深静脉血栓形成患者外周血miR-374a-5p、IL-10水平变化及其调控关系

刘婧，张云虹，赵霖，朱肖肖，张振，魏然，郭强，尹训强，周宪宾，王彬，李霞

(1济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南250200；2山东省医学科学院基础医学研究所；3临沂市兰山区妇幼保健院；4山东中医药大学附属医院)

深静脉血栓形成(DVT)是因静脉内膜损伤、血流缓慢和血液高凝状态引起的周围血管疾病，其发病率占周围血管疾病的40%[1]。DVT多发生于下肢，以肢体广泛性肿胀、疼痛、皮色暗红、浅静脉扩张等为主要临床表现。其血栓脱落可引发肺栓塞，严重威胁患者生命健康[2，3]。炎性细胞因子在DVT的发病中具有重要作用，其导致的血管内皮损伤参与了DVT形成与发展[4]。白细胞介素10(IL-10)是一种具有免疫调节作用的细胞因子，在抑制炎症、维持机体内环境稳定中发挥重要作用[5]。研究发现，DVT患者存在IL-10表达降低，可能在炎症损伤血管内皮功能中扮演了重要角色，但导致IL-10降低的原因尚不清楚[6]。微小RNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与转录后基因表达调控，在维持机体稳态中具有重要作用，但其在DVT发病中的作用尚不清楚[7，8]。本研究通过检测DVT患者血清IL-10水平及外周血单个核细胞(PBMC)中miR-374a-5p表达变化，探讨miR-374a-5p是否对IL-10存在调控作用，为临床治疗DVT提供新的靶点和思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2017年6月～2018年6月山东中医药大学周围血管病科就诊的急性期DVT患者。纳入标准：①符合第3版《深静脉血栓形成的诊断和治疗指南》[9]中的诊断标准，属于急性期混合型单纯下肢DVT；②单侧肢体发病，病程<15 d；③年龄18～80岁；④尚未采用溶栓等药物治疗。排除标准：①合并活动性下肢溃疡；②合并心、脑、肺疾病及肝、肾功能异常；③有出血性疾病或出血倾向；④妊娠期妇女。共收集DVT患者30例(DVT组)，男14例、女16例，年龄(56.6±7.2)岁。选取同期查体健康者30例作为健康对照组，男16例、女14例，年龄(53.4±6.5)岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者或家属签署知情同意书。

1.2 标本采集与试剂准备 受试者均于清晨空腹抽静脉血6 mL，EDTA-Na2抗凝，分离血清用于ELISA检测，人外周血淋巴细胞分离液分离PBMC用于qPCR检测。主要试剂:人外周血淋巴细胞分离液试剂盒购自索莱宝科技有限公司；人IL-10 ELISA购自杭州联科生物技术有限公司；TRIzol Reagent、UItraSYBR Mixture均购自北京康为世纪生物科技公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit购自东洋纺生物科技有限公司；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司；293T细胞及Hela细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；miR-374a-5p过表达(上游引物5′-UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG-3′,下游引物5′-CUUAUCAGGUUGUAUUAUAAUU-3′)、抑表达(5′-CACUUAGCAGGUUGUAUUAUAA-3′)、阴性对照(上游引物5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,下游引物5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)、miR-374a-5p及内参照U6逆转录引物与qPCR引物由上海吉玛公司设计合成，内参照GAPDH及目的基因IL-10 qPCR引物由上海博尚生物技术有限公司设计合成，引物序列见表1；野生型及突变型IL-10 mRNA 3′非翻译区(3′UTR)载体购自美国Promega公司。

1.3 血清IL-10蛋白检测 采用ELISA法。将1×洗液浸泡检测板30 s，按照说明书加入倍比稀释的标准品及样品。每孔加入检测抗体，混匀，室温孵育2 h，洗板6次；每孔加入稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，混匀，室温孵育45 min，洗板6次；每孔加入显色底物TMB避光，室温孵育15 min，每孔加入终止液，使用酶标仪进行450 nm、630 nm双波长下测定光密度(OD)值，绘制标准曲线后，依据OD450-OD630值计算IL-10蛋白浓度。

表1 基因引物序列及产物片段

1.4 PBMC中miR-374a-5p表达检测 采用qPCR法。TRIzol法提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度及纯度。根据miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书合成miRNA的cDNA，UltraSYBR Mixture PCR反应体系扩增。以U6为内参照，根据获得数据采用2ΔΔCt法计算miR-374a-5p的相对表达量。

1.5 miR-374a-5p与IL-10关系的生物信息学预测与验证 通过对差异基因的生物信息学分析，用Target Scan7.1程序预测miR-374a-5p与IL-10 mRNA 3′UTR是否存在结合位点。运用分子克隆技术，构建包含结合位点的野生型及突变型IL-10 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因pmirGLO载体；将293T细胞分为干预组和对照组，干预组同时转染空白对照NC与野生型或突变型IL-10 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因pmirGLO载体；转染24 h后收集细胞，采用双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶报告基因活性。

1.6 miR-374a-5p对IL-10表达的调控作用观察 将HeLa细胞分为3组，过表达组、抑表达组利用Lipofectamine 2000转染miR-374a-5p mimics及inhibitor，空白对照组转染空白对照NC；转染24 h之后收集细胞，qPCR检测各组细胞IL-10 mRNA水平，ELISA检测各组培养上清IL-10蛋白水平。①IL-10 mRNA：TRIzol法提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度及纯度。根据ReverTra Ace qPCR RT Kit及说明书合成mRNA，以UltraSYBR Mixture PCR反应体系扩增。以GAPDH为内参照，采用2-ΔΔCt法计算IL-10 mRNA的相对表达量。②IL-10蛋白：收集细胞上清液，检测方法同1.3.1。

2 结果

2.1 两组血清IL-10蛋白水平及PBMC中miR-374a-5p表达比较 与健康对照组比较，DVT组血清IL-10蛋白水平降低而PBMC中miR-374a-5p表达升高(P均<0.05)。见表2。

表2 两组血清IL-10蛋白水平及PBMC中miR-374a-5p表达比较

注：与健康对照组比较，*P<0.05。

2.2 miR-374a-5p与IL-10关系的生物信息学预测与验证结果 Target Scan7.1程序预测显示，miR-374a-5p与IL-10 mRNA 3′UTR之间具有潜在碱基互补结合位点，提示miR-374a-5p通过结合IL-10 mRNA 3′UTR进而调控IL-10表达。见表3。双荧光素酶报告基因系统检测显示，与对照组比较，干预组能降低野生型 IL-10 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因活性，但对突变型IL-10 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因活性无明显影响(P>0.05)。见表4。

表3 miR-374a-5p与IL-10 mRNA 3′UTR结合位点预测

表4 miR-374a-5p对IL-10 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因活性的影响

注：与对照组同型别比较，*P<0.05。

2.3 miR-374a-5p对IL-10表达的调控作用 与空白对照组比较，过表达组HeLa细胞IL-10 mRNA表达及上清液IL-10蛋白水平均降低(P均<0.05)，而抑表达组HeLa细胞IL-10 mRNA表达及上清液IL-10蛋白水平均升高(P均<0.05)。见表5。

3 讨论

DVT是周围血管常见疾病，且近年来发病率呈逐年升高的趋势[10,11]。DVT急性期容易发生血栓脱落，并发致死性肺栓塞，是临床猝死的重要原因之一；若延误治疗或治疗效果差，病情迁延可演变为血栓形成后综合征，长期影响肢体功能，并形成静脉性溃疡[12]。目前，DVT的发病机制尚不十分清楚。研究发现，细胞因子表达失衡导致的炎症损伤血管内皮细胞功能参与了DVT的发生与发展[1]。IL-10是重要的调节性细胞因子，主要由Th2细胞产生，也可来源于Th0细胞、单核巨噬细胞等。其主要功能是抑制Th1细胞的应答，还可间接抑制NK细胞活性等，在抑制过强的炎症反应，维持机体内环境稳定中发挥着重要作用[6]。研究表明，DVT患者血清IL-10水平降低。但是，导致IL-10表达降低的上游调控机制尚不清楚，深入探讨有望为调控细胞因子表达治疗DVT提供新的靶点与方法。

表5 各组HeLa细胞IL-10 mRNA表达及上清液IL-10蛋白水平比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05。

miRNA可通过与其靶基因3′UTR区特异性的不完全互补结合调控靶基因表达与功能，广泛参与调控细胞的增殖、分化、凋亡、信号转导等多种生理过程，在维持机体正常内环境稳定中发挥着重要作用，其表达异常参与了肿瘤、糖尿病、类风湿性关节炎等多种疾病的发生与发展[13]。但是，目前miRNA在DVT形成中的作用尚未阐明。有研究表明，miR-146a可能在DVT的纤溶—抗纤溶系统失衡过程中发挥重要调节作用[14]，let-7e-5p在DVT患者外周血中降低，而miR-483-3p和miR-195升高。这些miRNA在DVT患者中的差异表达，可作为DVT治疗的新的靶点，为DVT的细胞疗法提供了新的依据[8]。

本研究发现，DVT患者外周血PBMC中miR-374a-5p表达较正常对照升高，并且血清IL-10蛋白表达较降低，提示两者表达的变化参与了DVT的发生与发展。miR-374a-5p是长度为22个核苷酸的内源性非编码单链小RNA，其编码基因位于人的第Ⅹ号染色体。有研究报道，miR-374a-5p参与了炎症反应，在肥胖人群中其表达显著升高，但其在DVT中的作用尚不清楚[15]。同时，我们通过Target Scan生物信息软件分析发现，miR-374a-5p与IL-10 mRNA 3′UTR间存在潜在碱基互补结合位点，提示miR-374a-5p可能通过结合IL-10 mRNA 3′UTR进而抑制IL-10基因的表达及功能，导致机体内环境稳态失衡，引起炎症损伤血管内皮细胞，最终导致DVT形成。为了进一步证实miR-374a-5p对IL-10的调控作用，本研究在HeLa细胞中转染miR-374a-5p mimics上调miR-374a-5p表达，发现IL-10 mRNA及蛋白表达水平均降低；同时，我们发现在转染miR-374a-5p inhibitor下调miR-374a-5p表达后，IL-10 mRNA及蛋白表达水平升高，进一步证实miR-374a-5p对IL-10表达及功能具有负向调控作用。本研究从表观遗传免疫调控角度阐释了DVT的可能发病机制，为DVT临床诊断及治疗提供了新的分子生物学指标，靶向调控miR-374a-5p调节细胞因子表达可能为DVT治疗的效靶点与途径。