补阳还五汤对矽肺大鼠肺纤维化的影响及机制

张蓉，宋占帅，邹建芳

(1济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南250200；2山东省职业卫生与职业病防治研究院；3山东中医药大学)

矽肺是以肺组织纤维化为主的疾病，目前的治疗选择十分有限。近年研究显示，转化生长因子β1(TGF-β1)是致肺组织纤维化关键性的细胞因子，而细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路介导的促增殖作用则是肺纤维化过程中必不可少的[1]。中医学将矽肺归为“咳嗽”“肺痿”“喘证”“肺痹”等范畴，认为其病位在肺，病机为气虚血瘀，故治疗矽肺纤维化的基本原则为益气活血。补阳还五汤出自王清任的《医林改错》，是益气活血法的代表方剂。我们的前期研究发现，补阳还五汤能够抑制TGF-β1在肺内的高表达，减轻肺纤维化程度[2]。2017年6～12月，我们通过制作大鼠矽肺模型，观察补阳还五汤对肺泡炎症和肺纤维化的影响，并以TGF-β1/ERK信号通路为靶点，探讨补阳还五汤干预矽肺纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠120只，3～4月龄，体质量(220±20)g，由山东鲁抗医药股份有限公司质监中心实验动物室提供。适应环境饲养1周，大鼠在温度20～24 ℃、相对湿度50%～60%、自然光照的动物房中饲养。普通饲料喂养，饲料由山东省职业卫生与职业病防治研究院实验动物中心提供。大鼠自由摄食、饮水。

1.1.2 药品、试剂和仪器 将二氧化硅粉末高温干燥后，用蒸馏水配制成浓度为50 mg/mL的混悬液。补阳还五汤由黄芪、赤芍、桃仁、红花、当归、川芎、地龙组成，药物比例为5∶1∶1∶1∶1∶1∶1。浓缩药液至含原药材1 g/mL，灭菌，置4 ℃冰箱中保存备用。强的松(浙江仙琚制药股份有限公司)，TGF-β1抗体(福州迈新生物技术开发公司)，p-ERK、ERK1/2抗体(美国CST公司)，BCA蛋白测定试剂盒(美国PIERCE公司)。主要仪器为酶标检测仪、冷冻离心机、校准型光密度仪等。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模 将大鼠随机分为对照组、模型组、补阳还五汤高剂量组、补阳还五汤中剂量组、补阳还五汤低剂量组，每组24只。模型组和补阳还五汤高、中、低剂量组采用一次性非暴露式二氧化硅气管滴注法制作矽肺模型[3]。大鼠麻醉后，模型组及补阳还五汤不同剂量组气管内滴注1 mL二氧化硅混悬液，对照组气管内滴注1 mL生理盐水。

1.2.2 给药干预与标本采集 造模成功后第2天，对照组和模型组均给予10 mL/(kg·d)生理盐水灌胃，补阳还五汤高、中、低剂量组分别给予18.48、9.24、4.62 g/(kg·d)补阳还五汤灌胃，连续28 d。造模后7、14、28 d每组分别取8只大鼠，麻醉后仰卧固定，腹主动脉放血，开胸，摘取右肺中、上叶100 mg，置于EP管中，液氮中保存。

1.2.3 肺组织病理学观察 取肺组织，常规石蜡包埋，切片，行HE染色和Masson染色，观察组织病理学改变。根据文献[4]方法评估肺泡炎和肺纤维化程度。肺泡炎：0分：无肺泡炎；1分：轻度肺泡炎，有局部病灶，肺组织病变范围<20%，且有良好的肺泡结构；2分：中度肺泡炎，肺组织病变范围占20%～50%；3分：重度肺泡炎，弥漫性肺泡炎，肺组织病变范围>50%。肺间质纤维化程度：0分：无间质纤维化；1分：轻度间质纤维化，有局部病灶，肺组织病变范围<20%；2分：中度间质纤维化，肺组织病变范围占20%～50%；3分：重度间质纤维化，广泛的间质纤维化，肺组织病变范围>50%，有大量实质性损伤。

1.2.4 肺组织TGF-β1表达检测 采用免疫组化SP法。取肺组织，加入4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片；二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，枸櫞酸钠修复液微波100 ℃ 6 min、80 ℃ 6 min抗原修复；加入3% H2O2溶液37 ℃孵育30 min，PBS漂洗；加入山羊抗血清37 ℃封闭30 min；滴加TGF-β1抗体(浓度1∶800)，4 ℃过夜，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗；滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗;DAB显色，封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。光镜下阳性细胞呈棕黄色。采用双盲法评分，每张切片观察5个高倍视野。染色强度评分：无染色为0分、轻度染色为1分、中度染色为2分、高度染色为3分；染色细胞所占比例评分：无细胞染色为0分、<25%为1分、25%～50%为2分、>50%为3分。以两项评分之和表示TGF-β1的表达水平。

1.2.5 肺组织p-ERK、ERK1/2表达检测 采用Western blotting法。取大鼠肺组织50 mg，剪碎匀浆，加入蛋白裂解液裂解，收集上清液，采用BCA定量蛋白试剂盒进行蛋白定量检测。取60 μg蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质组分后，转印蛋白于醋酸纤维素膜上。将含p-ERK、ERK1/2抗体(1∶1 000稀释)和β-actin(1∶1 000稀释)抗体摇床孵育过夜，用TBST漂洗。将山羊抗兔IgG-HRP用TBST稀释3 000倍，室温下孵育30 min，TBST漂洗。ECL液显影，X光胶片曝光后进行显影、定影。内参蛋白为β-actin，以目的蛋白与相应内参的灰度值之比来定量分析各目的蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 各组不同时间肺组织肺泡炎评分、肺纤维化评分比较 与对照组相比，其他各组肺泡炎评分、肺纤维化评分在7、14、28 d时均升高(P均<0.01)；与模型组相比，补阳还五汤各剂量组肺泡炎评分、肺纤维化评分均下降(P均<0.01)。见表1。

表1 各组不同时间肺组织肺泡炎评分、肺纤维化评分比较(分，

注：与对照组同期比较，*P<0.01；与模型组同期比较，#P<0.01。

2.2 各组不同时间肺组织TGF-β1表达比较 与对照组相比，其他各组TGF-β1表达均升高(P均<0.01)；与模型组比较，补阳还五汤各剂量组TGF-β1表达均降低(P均<0.01)。见表2。

表2 各组不同时间肺组织TGF-β1表达比较

注：与对照组同时间比较，*P<0.01；与模型组同时间比较，#P<0.01。

2.3 各组不同时间肺组织p-ERK、ERK1/2表达比较 与对照组相比，其他各组p-ERK、ERK1/2表达均增高(P<0.05或<0.01)；与模型组相比，补阳还五汤各剂量组p-ERK、ERK1/2表达均降低(P<0.05或<0.01)。见表3。

3 讨论

矽肺是由于在生产过程中长期吸入游离二氧化硅(石英)含量过高的粉尘而引起的以肺泡炎症和肺组织纤维化为主的疾病[4，5]。目前我国不仅矽肺患病人数多，而且病情呈渐进性加重，现已成为影响经济健康持续发展的重大公共卫生和社会问题。临床上治疗肺纤维化以糖皮质激素和免疫抑制剂为主，但这些免疫抑制剂抗纤维化效果有限，长期存活率差，并且会引起许多不良反应[6]。因此，亟需寻求矽肺治疗的新方法和新药物。矽肺的发病机制至今仍未完全阐释清楚。近年来中医药防治肺纤维化已成为抗矽肺纤维化的重点，中医对该病的认识与研究日趋成熟，在临床和实验中发现了很多对预防和治疗肺纤维化有效的药物。祖国传统医学源远流长，认为肺主气，对于肺纤维化，归属于“肺痹”“肺萎”等病证范畴，因此益气活血法为治疗肺纤维化的基本方法。补阳还五汤为益气活血的经典代表方，出于清代名医王清任《医林改错》一书，功效主要为补气活血、祛瘀通络。实验研究表明益气养阴、活血化瘀中药能够抑制动物模型肺纤维化胶原合成和沉积，从而发挥抗肺纤维化作用[7，8]。

表3 各组不同时间肺组织ERK1/2表达比较

注：与对照组同时间比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组同时间比较，#P<0.05，##P<0.01。

矽肺肺纤维化的发展包括肺泡炎症反应和纤维化形成两个阶段[9]。研究表明，急性肺泡炎是矽肺纤维化的早期病变基础，在肺泡炎形成过程中涉及很多细胞因子[10]，肺泡炎评分一定程度反映了肺组织肺泡炎的程度。而肺纤维化评分则是一定程度上反应肺组织间质纤维化的水平。本研究结果显示，与对照组相比，其他各组肺泡炎评分、肺纤维化评分在7、14、28 d时均升高；与模型组相比，补阳还五汤各剂量组肺泡炎评分、肺纤维化评分均下降。本研究中病理结果量化评分显示，矽肺纤维化早期肺泡炎程度较纤维化形成期更严重，补阳还五汤各剂量治疗组与模型组相比，肺泡炎性浸润减少，且肺泡炎及纤维化程度随补阳还五汤剂量增加而减轻，表明补阳还五汤在减轻矽尘引起的肺损伤过程中具有抗炎抗纤维化作用。

TGF-β1是关键性的致矽肺纤维化的细胞因子，其主要作用是促进肺成纤维细胞过度增殖、分化，进而促使胶原蛋白等细胞外基质在肺泡间和肺间质过度聚积，导致矽肺纤维化的发生发展[11，12]。ERK通路是由TGF-β1介导的肺纤维化形成过程中重要的通路之一[13]。有研究显示，ERK1/2在肺泡炎症和纤维化阶段均参与了肺纤维化的发病过程[14]。国内外研究表明，在二氧化硅、石棉等所致肺纤维化的模型中均有ERK表达增加[15]。进一步证明ERK信号通路参与了肺纤维化病变的发生。目前，对于细胞内信号传导通路的研究是矽肺纤维化的研究重点[16]。我们以大鼠矽肺纤维化模型为载体，观察补阳还五汤对TGF-β1/ERK信号通路相关蛋白TGF-β1、ERK1/2、p-ERK表达的影响。与对照组相比较，同期模型组中TGF-β1、ERK1/2及p-ERK的表达显著增高,尤其中后期高表达情况异常突出。与模型组相比较，各给药组中同期TGF-β1、ERK1/2、p-ERK的表达均有下降。表明补阳还五汤可通过抑制TGF-β1、ERK1/2及p-ERK的高表达，而抑制矽肺纤维化的发生发展。

综上所述,补阳还五汤可以有效降低肺泡炎及肺纤维化评分，并能抑制矽肺肺组织中TGF-β1、ERK1/2及p-ERK的表达上调，提示补阳还五汤能够较好的调控TGF-β1/ERK信号通路，进而抑制其产生的促增殖作用，进而抑制矽肺纤维化的发生发展。