海南地区2型糖尿病并发冠心病老年患者ALDH2基因多态性特征及其对冠状动脉狭窄的影响

吴和弟，许丽娃，吉家钗，陈训春，王少津

(海口市人民医院，海口570208)

研究显示，2型糖尿病患者发生冠状动脉狭窄的风险显著升高，与非2型糖尿病患者相比，2型糖尿病患者发生冠状动脉狭窄的风险增加8～15倍，且患者预后较差[1，2]。目前关于2型糖尿病发生冠状动脉狭窄的机制仍未完全明确，给临床预防和治疗带来了困难。乙醛脱氢酶2(ALDH2)是人体内重要的醛类氧化酶，主要作用为催化乙醛氧化成乙酸。ALDH2基因突变在冠状动脉粥样硬化的发生发展中起到重要作用，是心脑血管疾病发生的重要因素[3，4]。已有研究表明，ALDH2基因多态性可影响2型糖尿病患者的血糖水平[5，6]。而ALDH2基因多态性是否是增加2型糖尿病患者冠状动脉狭窄风险仍未有定论。本研究探讨了海南地区2型糖尿病老年患者并发冠状动脉狭窄风险与ALDH2基因多态性的相关性。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1月～2016年12月海口市人民医院收治的2型糖尿病患者300例。纳入标准：符合WHO制定的2型糖尿病诊断标准[7]；本地出生的常住人口，年龄>60岁；均行选择性冠状动脉造影检查。排除标准：合并免疫系统疾病、恶性肿瘤、肝肾功能障碍；近3个月内患有感染性疾病；有血缘关系者。根据冠状动脉造影结果，以单支或多支冠状动脉狭窄程度≥30%确诊为冠心病，将患者分为冠心病组159例和非冠心病组141例。冠心病组男97例、女62例，年龄61～76(68.06±4.10)岁，BMI(25.19±2.87)kg/m2，收缩压(138.84±21.35)mmHg、舒张压(84.35±10.76)mmHg，总胆固醇(TC)为(5.53±1.43)mmol/L、甘油三酯(TG)为(1.95±1.03)mmol/L、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)为(3.43±1.07)mmol/L、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)为(1.09±0.43)mmol/L；非冠心病组男89例、女52例，年龄60～77(68.43±5.08)岁，BMI(24.56±2.42)kg/m2，收缩压(137.89±19.34)mmHg、舒张压(85.19±11.43)mmHg，TC(5.34±1.21)mmol/L、TG(1.92±1.07)mmol/L、LDL-C(3.29±1.12)mmol/L、HDL-C(1.13±0.47)mmol/L。两组性别、年龄、BMI、血压、血脂具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 ALDH2基因多态性检测方法

1.2.1 DNA提取 采集患者空腹外周静脉血10 mL，加入枸橼酸钠抗凝。加入Ficoll淋巴细胞分离液分离白细胞，应用DNA提取试剂盒(武汉博士德有限公司)提取基因组DNA。取1 μL样品，利用分光光度计检测DNA浓度与纯度，当OD260/OD280在1.0～1.8表明样本达标。

1.2.2 引物设计及合成 引物序列由苏州吉玛生物技术有限公司设计合成，上游引物5-GTCAACTGCTATGATGTGTTTGG-3′，下游引物5′-CCACCAGCAGACCCTCAAG-3′。

1.2.3 PCR扩增及产物测序 PCR反应体系：上、下游引物各2 μL，模板DNA 2 μg，Master Mix 25 μL，总反应体系50 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取扩增产物，采用2%琼脂糖凝胶电泳，电压80 V，电泳时间25 min。紫外线分析凝胶成像系统下观察结果。ALDH2基因扩增产物送苏州吉玛生物技术有限公司测序，根据样本测序结果对相关基因位点进行人工比对，分析基因多态性。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料以百分数表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Logistic回归分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALDH2基因测序结果 患者ALDH2基因型有3种，即GG型、AG型、AA型。

2.2 两组ALDH2基因型及等位基因分布情况比较 冠心病组和非冠心病组ALDH2基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。冠心病组GG基因型频率低于非冠心病组，AA基因型频率高于非冠心病组，G等位基因频率低于非冠心病组，A等位基因频率高于非冠心病组。两组AA基因型频率、AG基因型频率均低于GG基因型频率，A等位基因频率低于G等位基因频率(P均<0.05)。见表1。

表1 两组ALDH2基因型及等位基因分布情况比较[例(%)]

注：与AG基因型比较，aP<0.05；与AA基因型比较，bP<0.05；与A等位基因比较，cP<0.05。

2.3 不同性别患者基因型及等位基因频率分布情况 不同性别患者ALDH2基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。男性与女性患者比较，ALDH2基因型频率、等位基因频率分布差异无统计学意义(P均>0.05)。男性和女性患者的AA基因型频率、AG基因型频率均低于GG基因型频率，A等位基因频率低于G等位基因频率(P均<0.05)。见表2。

表2 不同性别患者ALDH2基因型及等位基因分布情况比较[例(%)]

注：与AG基因型比较，aP<0.05；与AA基因型比较，bP<0.05；与A等位基因比较，cP<0.05。

2.4 不同年龄患者基因型及等位基因频率分布情况 不同年龄患者ALDH2基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。≤70岁患者与>70岁患者ALDH2基因型频率、等位基因频率分布差异无统计学意义(P均>0.05)。≤70岁患者与>70岁患者的AA基因型频率、AG基因型频率均低于GG基因型频率，A等位基因频率低于G等位基因频率(P均<0.05)。见表3。

表3 不同年龄患者基因型及等位基因分布情况比较[例(%)]

注：与AG基因型比较，aP<0.05；与AA基因型比较，bP<0.05；与A等位基因比较，cP<0.05。

2.5 2型糖尿病患者冠状动脉狭窄危险因素分析 以是否发生冠心病为因变量，以ALDH2等位基因频率为自变量行Logistic回归分析，在调整性别、年龄因素后，A等位基因是2型糖尿病患者冠心病发病的危险因素(OR=2.426，95%CI为1.312～4.526，P=0.005)。

3 讨论

2型糖尿病合并冠状动脉狭窄患者的病死率显著高于单纯2型糖尿病患者，因此研究2型糖尿病患者发生冠状动脉狭窄的风险及机制具有重要意义。以往研究认为，高血糖、高血压、脂代谢紊乱是冠状动脉粥样硬化的重要危险因素[9]。但仅通过高血压、高血糖、脂代谢紊乱并不能完全解释2型糖尿病患者发生冠状动脉狭窄的机制。近年研究显示，基因多态性在糖尿病、冠心病、恶性肿瘤等疾病的发生发展中起重要作用[10]。ALDH是乙醇代谢的关键酶，与人类的饮酒行为、乙醇代谢和乙醇耐受等密切相关[11]。ALDH2是ALDH的重要亚型，具有心血管保护功能，而ALDH2突变与心脑血管疾病的发生、发展有密切关系。You等[12]报道，ALDH2可以通过抑制解毒4-HNE途径，降低活性氧生成，从而降低心肌细胞损伤。Adeniji等[13]报道，上调ALDH2表达可有效降低动脉粥样硬化损伤，并发挥抗心肌细胞凋亡作用。Koppes等[14]报道，ALDH2基因多态性影响2型糖尿病患者的血糖，携带突变型ALDH2基因的2型糖尿病患者的血糖更难于控制。

人类ALDH2基因位于第12号染色体，第487位碱基有一个突变位点，可出现GG型、AG型、AA型三种基因型[15]。相关研究显示，不同种族人群ALDH2基因型具有明显差异。海南地区位于我国最南端，地处热带北缘、四面环海，气候湿润。海南省民族众多，但汉族仍是主体民族，占80%以上，黎族、苗族、壮族为主要少数民族，约占17%，研究海南2型糖尿病老年患者并发冠状动脉狭窄风险与ALDH2基因多态性的关系具有重要意义。研究发现，不同性别、年龄的2型糖尿病患者冠状动脉狭窄发病率不同，其中女性2型糖尿病患者冠状动脉狭窄发病率高于男性，而高年龄段2型糖尿病患者冠状动脉狭窄发病率则更高。本研究结果显示，不同性别、不同年龄ALDH2基因型频率、等位基因频率分布差异无统计学意义，表明海南地区2型糖尿老年病患者ALDH2基因型频率与性别、年龄无关。不同性别、年龄的2型糖尿病患者冠状动脉狭窄发病率不同与ALDH2基因多态性可能无明显关系。进一步分析发现，冠心病组GG基因型频率低于非冠心病组，AA基因型频率高于非冠心病组，G等位基因频率低于非冠心病组，A等位基因频率高于非冠心病组。

目前，关于ALDH2基因多态性具体通过何种机制影响2型糖尿病患者发生冠状动脉狭窄的风险仍不十分明确。我们认为可能与以下因素有关：①ALDH2的A等位基因突变导致T2DM患者血糖更难于控制，增加胰岛素抵抗，促进动脉粥样硬化发生风险[16,17]；②ALDH2的A等位基因突变导致其解毒4-HNE途径、抑制乙醛产生作用降低，影响心肌病保护功能[18]；③ALDH2的A等位基因突变影响机体乙醇代谢和乙醇耐受，促进动脉粥样硬化形成[19]。其具体机制有待进一步研究证实。本研究结果显示，2型糖尿病合并CHD患者A等位基因频率升高，ALDH2基因多态性有可能成为2型糖尿病老年患者冠状动脉狭窄发生的独立危险因素。但本研究仍存在一定不足，因少数民族样本数量较少，未对各民族基因多态性进行比较，有待后续大样本补充。

综上所述，2型糖尿病老年患者并发冠状动脉狭窄风险与ALDH2基因多态性有关，ALDH2的A等位基因增加了2型糖尿病患者罹患冠状动脉狭窄的危险。