下调ANKRD22表达对人肺腺癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

张烽，殷俊，傅文凡，戴璐，潘雷，钟圣鹏，赵健

(广州医科大学附属肿瘤医院，广州510095)

随着人口增长及老龄化的双重作用，肺癌已成为我国恶性肿瘤死亡的首要原因。由于缺乏针对肺癌的早期筛查及诊断的特异性生物学标志，且肺癌早期并无明显临床症状，多数患者确诊时已是中晚期，预后极差，5年生存率低于10%[1]。寻找新的肺癌发生标志物、研发更多靶向药物对肺癌的诊治具有重要意义。锚蛋白重复序列(ANKRD)是自然界中存在于真核、原核及病毒中的一种蛋白质序列模体，其家族成员数量众多，参与生物体的各种生理过程，如细胞骨架完整性、细胞周期控制、转录、细胞信号传导、发育和分化、细胞凋亡、囊泡运输、炎症反应、植物抗性和细菌侵袭等[2，3]，并存在于从病毒到人类的大多数物种中[4]。在前期研究中，我们通过基因芯片检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者的肿瘤组织和癌旁组织，发现ANKRD22在肿瘤组织中表达明显增高，提示其可能与NSCLC的发生发展有关[5]，但ANKRD22在NSCLC发病过程中的作用尚不明确。2017年5月～2018年5月，我们通过RNA干扰技术下调人NSCLC细胞株H1975中ANKRD22的表达，并通过一系列的细胞功能试验，探讨ANKRD22对NSCLC细胞的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人NSCLC细胞株H1975，由广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所保存。ANKRD22-siRNA质粒和阴性对照质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。RPMI1640完全培养基、胎牛血清(FBS)及0.25%胰蛋白酶消化液(美国Corning公司)，噻唑蓝(MTT，美国Sigma公司)，TRIzol(美国Life公司)，QuantScript RT Kit及Talent荧光定量检测试剂盒(SYBR Green，北京天根生化科技有限公司)，Lipofectamine 2000 Reagent(美国Invitrogen公司)，细胞凋亡和细胞周期检测试剂盒(杭州联科生物技术有限公司)。CO2恒温培养箱、恒温水浴箱(德国Thermo Fisher Scientific公司)，倒置显微镜(德国Leica公司)，普通PCR仪(德国Eppendorf公司)，7500型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，多功能酶标仪(美国BioTEK公司)，FACSCantoⅡ流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 细胞培养 将细胞加入含10% FBS的RPMI1640培养基中，5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养。当细胞融合约90%时，加入0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3传代。取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3 细胞转染 取对数生长期细胞，按2×105/孔接种于6孔板(内含10% FBS的RPMI1640培养基)。将细胞随机分为空白对照组、阴性对照组和siRNA干扰组。siRNA干扰组和阴性对照组按照Lipofectamine 2000 Reagen说明分别转染ANKRD22-siRNA质粒和阴性对照质粒，空白对照组不转染。转染24 h后收集细胞，用于后续实验。

1.4 细胞中ANKRD22表达检测 采用实时荧光定量qRT-PCR法。使用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系共20 μL：10 μL SYBR Green PCRMaster Mix，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，无核酶水补足至20 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。使用StepOneTM软件在72 ℃时采集荧光信号，并进行熔解曲线分析。以GAPDH为内参照，采用2-ΔΔCt法计算ANKRD22的相对表达量。

1.5 细胞增殖能力观察 采用MTT法。取对数生长期细胞，按1.3方法进行分组、转染。培养24 h，收集细胞，按1×103/孔接种于96孔板(内含10% FBS的RPMI1640培养基)，每孔加入200 μL，实验设3个复孔。分别于培养24、48、72、96、120 h加5 g/L MTT溶液20 μL孵育4 h，吸出孔内液体，加入DMSO 150 μL，震荡混匀10 min，上酶标仪于570 nm波长处检测各孔的吸光度(A)值，以A570值表示细胞增殖能力。

1.6 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。取对数生长期细胞，按1.3方法分组、转染。培养24 h后收集细胞，4 ℃、1 000 r/min离心5 min，去上清；PBS洗涤，再次离心、去上清。加入结合缓冲液100 μL重悬细胞，加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-AAD混匀，室温避光孵育15 min。加入结合缓冲液400 μL重悬细胞。上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 细胞周期检测 采用流式细胞术。取对数生长期细胞，按1.3方法进行分组、转染。培养24 h后收集细胞，4 ℃、1 000 r/min离心5 min，去上清；PBS洗涤，再次离心、去上清。加入1 mL DNA染色液，涡旋震荡5～10 s混匀。室温避光孵育30 min。上流式细胞仪检测各周期细胞所占比例。

2 结果

2.1 各组ANKRD22相对表达量比较 空白对照组、阴性对照组、siRNA干扰组ANKRD22相对表达量分别为1.000±0.000、0.931±0.065、0.312±0.047。siRNA干扰组ANKRD22相对表达量低于空白对照组和阴性对照组(P均<0.05)，空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组细胞增殖能力比较 siRNA干扰组培养24、48、72、96、120 h时，细胞增殖能力均低于空白对照组和阴性对照组(P均<0.05)，空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖能力比较

注：与空白对照组相同时间点比较，*P<0.05；与阴性对照组相同时间点比较，#P<0.05。

2.3 各组细胞凋亡率比较 空白对照组、阴性对照组、siRNA干扰组细胞凋亡率分别为30.53%±0.84%、31.42%±0.69%、40.71%±0.72%，siRNA干扰组细胞凋亡率高于空白对照组和阴性对照组(P均<0.05)，空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 各组细胞周期比较 siRNA干扰组G0/G1期细胞比例高于空白对照组和阴性对照组，S期、G2/M期细胞比例低于空白对照组和阴性对照组(P均<0.05)；空白对照组和阴性对照组各周期细胞比例比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组细胞周期比较

注：与空白对照组同期比较，*P<0.05；与阴性对照组同期比较，#P<0.05。

3 讨论

ANKRD一般含有33或34个氨基酸残基，依靠结构区域的相互折叠在空间上形成螺旋环结构，其主要功能是介导及调节蛋白质之间的相互作用[6]。ANKRD能够与多种配体相结合，实现复杂的生物功能，其中一部分直接参与肿瘤的发生[7]。研究显示，ANKRD蛋白家族与多种癌症的发生密切相关。ANKRD1与卵巢癌的形成及化疗药物敏感相关[8]；ANKRD13能够调控配体激活表皮生长因子受体(EGFR)的快速内化[9]；Ankrd17是细胞周期素(Cyclin) E/Cdk2的重要下游效应物，能够正向调节G1/S期细胞转移[10]；ANKRD26是脂肪发生的新型重要调控因子，为调节脂肪发生提供了新的靶点[11]。Liu等[12]对肺癌患者的血清及痰液中的ANKRD18B基因进行检测，发现ANKRD18B基因异常甲基化能够影响肺癌的发生发展，DNA甲基化导致ANKRD18B基因表达失活，进而抑制细胞的增殖和迁移能力，促进细胞凋亡，参与肿瘤的发生。Octavio等[13]报道，ANKRD22可能是胰腺癌的标志物，其表达可反映肿瘤患者对免疫治疗的不同疗效。胰腺癌患者的血清和外周血单个核细胞中ANKRD22表达较正常人升高[13，14]，ANKRD22在外周血中的水平可作为胰腺导管腺癌的诊断指标[15]。

肿瘤的发生与肿瘤细胞恶性增殖有关，抑制肿瘤细胞增殖是治疗肿瘤的有效手段。本研究结果显示，siRNA干扰组的细胞增殖能力低于空白对照组和阴性对照组，且随着作用时间延长，细胞增殖能力不断下降。表明干扰ANKRD22表达可抑制H1975细胞增殖，可能成为潜在的抗肺癌细胞增殖的手段。

细胞凋亡是一种在基因控制下细胞主动参与的“自杀”过程。正常细胞通过增殖和凋亡来维持自身稳定，若凋亡信号下调，细胞可异常增殖，最终导致肿瘤的发生，因此诱导肿瘤细胞凋亡也是抗肿瘤的一种重要机制。本研究结果显示，siRNA干扰组的细胞凋亡率高于空白对照组和阴性对照组，表明干扰ANKRD22表达能够促进H1975细胞凋亡。

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，由Cyclin依次激活相应的细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)所推动。Cyclin的周期性积累与分解对细胞周期起正调控作用,而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子通过在细胞周期适当的时间点上抑制CDK的活性，从而对细胞周期起负调控作用。肿瘤共同的生物学特征是失控性生长，其主要分子机制是细胞周期紊乱导致细胞增殖过多和凋亡过少。本研究发现，siRNA干扰组细胞阻滞于G0/G1期，S期、G2/M期细胞比例均减少。这提示ANKRD22对肿瘤细胞周期有调节作用，干扰ANKRD22对细胞周期的影响可能是其抑制肺癌进一步进展的潜在机制。

综上所述，抑制ANKRD22基因表达可抑制肺癌细胞增殖并促进其凋亡，延长细胞周期，从而发挥抑癌作用。ANKRD22可能成为肺癌个性化治疗的一个新方向。但本研究仅是ANKRD22体外实验的初探，在人体内抑制ANKRD22的表达能否能起到抑癌作用有待进一步研究。