REST在宫颈鳞状细胞癌组织中表达及其对KCa3.1的影响

李小芳，高兰阳，詹平，毛熙光

(西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)

宫颈癌是最常见的生殖道恶性肿瘤，其发病率居女性恶性肿瘤的第二位，仅次于乳腺癌[1]。宫颈癌的发生与某些离子通道的活性或表达改变密切相关。中电导钙激活钾离子通道(KCa3.1)在多种肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用[2]。前期研究发现KCa3.1在宫颈癌细胞增殖和侵袭中发挥重要作用[3～5]。抑制元件l沉默转录因子 (REST)又称神经元限制性沉默因子，其不仅有调控神经元发生和分化的功能，还有参与转绿调控、肿瘤形成等作用[6]。REST在非神经系统肿瘤细胞中发挥肿瘤抑制作用[7]。相关研究显示REST在小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌中低表达或缺失[8～10]。Yu 等[11]研究发现，REST的细胞质转位可能与肝肿瘤发生有关。KCa3.1启动子区含有2个串联的RE1位点，REST结合在这2个位点上，负调控 KCa3.1的表达[12，13]。相关研究证实KCa3.1基因表达量上升增强KCa3.1钾离子通道的活性，促进癌细胞增殖、侵袭和转移等生物特性[14，15]，研究发现KCa3.1在宫颈癌癌细胞增殖和侵袭中有重要作用，尚未有关在宫颈鳞状细胞癌组织中REST是否通过结合KCa3.1启动子RE1位点负调控KCa3.1表达的报道。2018年4～12月，我们检测了REST在宫颈鳞状细胞癌组织中表达，并探讨其对KCa3.1的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2017年1～12月我院宫颈鳞状细胞癌术后石蜡标本30例份，患者年龄36～51岁，中位年龄43岁，癌旁组织(距离癌组织2 cm)20例份(病理学证实不存在肿瘤)，选同期子宫肌瘤或子宫腺肌症全子宫切除的正常宫颈组织20例份用于免疫组化。选取同期我院妇科手术切除的宫颈鳞状细胞癌标本30例份，癌旁组织20例份，正常宫颈组织标本20例份，手术切除标本立即放入-80 ℃冰箱中保存用于qRT-PCR检测。选取同期手术切除宫颈鳞状细胞癌标本5例份，癌旁组织5例份，正常宫颈组织5例份，手术切除标本立即放入液氮中保存用于染色质免疫共沉淀技术(ChIP)-qPCR 检测，上述组织标本均经病理学确诊，术前未行放疗、化疗、生物治疗或免疫治疗的原发肿瘤。

1.2 REST基因在不同组织中表达量分析 利用数据库NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)、UCSC (http://genome.ucsc.edu/)、 ensemble(http://asia.ensembl.org/index.html)、Gene Cards(https://www.genecards.org/)查阅REST的表达情况，对已有数据进行分析整理。结果REST 在正常非神经细胞中高表达，在分化成熟的神经细胞中低表达，在正常宫颈组织中高表达。

1.3 REST蛋白在不同宫颈组织中的表达检测 采用免疫组化法。石蜡标本切片，切片厚度4 μm，采用免疫组化SP法，一抗 REST工作浓度为1∶100，以PBS代替一抗染色作为阴性对照，DAB显色。结果判定：以胞质和胞核中出现棕黄色颗粒或棕褐色颗粒为阳性。每例均随机观察5个高倍视野(×400)，用半定量积分法判断，将阳性细胞所占的百分比分值和染色强度分值相乘为结果：0～2为阴性，3及以上为阳性。

1.4 REST、KCa3.1 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。取100 mg冻存组织，放入盛有液氮的研钵中研磨，TRIzol试剂提取总mRNA。nanodrop测定并计算mRNA的浓度和纯度，同时进行1%变性琼脂糖凝胶电泳评估mRNA 的完整性。应用RT-PCR试剂盒将合格的mRNA 样品反转录成cDNA，以cDNA 为模板进行PCR扩增。反应体系为20 μL。引物和探针通过Premier 5.0软件设计，由上海英骏生物技术有限公司合成。REST正向引物：5′-AGTGAAAGGGCACGGAAGG-3′；反向引物：5′-TGGCAGTGGTGGTGATGG-3′，扩增片段长度123 bp。KCa3.1正向引物:5′-CAGCATCGGCGCTCTCAATC-3′；反向引物：5′-GGCAGCGGACTCCTTCATCT-3′;扩增片段长度409 bp。内参GAPDH正向引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′；反向引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，扩增片段长度225 bp。反应条件：95 ℃ 5 min 预变性；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，共40个循环。以 2-ΔΔCt法计算REST mRNA 的相对表达量。

1.5 REST在KCa3.1启动区富集检测 用REST的抗体进行ChIP实验。取150 mg组织冰上剪碎，37%的甲醛 37 ℃孵育15 min使蛋白质和DNA发生交联。甘氨酸终止交联。4 ℃，1 200 g离心5 min，收集组织沉淀，Dounce匀浆器研磨处理。加入1 mL细胞裂解缓冲液冰上孵育10 min，4℃，1 200 g离心5 min，收集组织沉淀。加入1 mL细胞核裂解液，冰上超声：SONOPUIS MIMI120，25%功率，10 s冲击，30 s间隙，共20次。21 000 g 4 ℃离心 10 min，取上清，每50 μL分装一管。取10 μL DNA溶液进行1%琼脂糖凝胶电泳以确定DNA片段大小。超声破碎产物加入450 μL ChIP缓冲液，取 10 μL (2 %)样品做为"input"。加入2 μg一抗，在阴性对照中加入相应的兔IgG，加入 30 μL 蛋白G磁珠，4 ℃颠转混匀过夜。磁架吸附蛋白G磁珠，分别用低盐漂洗液、高盐漂洗液清洗。连同"input"每 EP 管各加入150 μL 1×ChIP缓冲液，65 ℃振荡孵育30 min。磁架吸附 protein G磁珠转移上清。加入2 μL蛋白酶K 65 ℃振荡孵育2 h。离心柱纯化DNA。进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 REST与 KCa3.1 启动子结合情况分析 采用ChIP-qPCR法。取纯化后DNA，以KCa3.1启动子区RE1位点设计引物，qPCR 进行定量分析REST与 KCa3.1 启动子结合情况。反应体系20 μL；RE1正向引物：5′-ACATACAACCTTGCCCCTTC-3′；反向引物:5′-GTCTTTTGTCCTCCGTTAGTTG-3′。反应条件：95 ℃ 3 min 预变性；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，共 40个循环。以 2-ΔΔCt分析PCR结果。

2 结果

2.1 REST在不同宫颈组织中的表达比较 REST蛋白阳性反应主要定位于细胞质和细胞核。在正常宫颈组织和癌旁组织中均检测到REST蛋白不同程度的表达，阳性率为100%，宫颈鳞状细胞癌组织中REST蛋白的阳性率为40%。

2.2 不同组织中REST与KCa3.1 基因表达量 宫颈鳞状细胞癌、癌旁、正常宫颈组织中REST基因相对表达量分别为0.46±0.06、0.89±0.13、1±0.12；宫颈鳞状细胞癌中REST基因相对表达量较癌旁组织和正常宫颈组织分别下降48%、54%；宫颈鳞状细胞癌、癌旁、正常宫颈组织中KCa3.1 基因表达量分别为2.14±0.35、1.18±0.21、1±0.13，宫颈鳞状细胞癌中KCa3.1 基因表达量较癌旁组织和正常宫颈组织分别上升81%、114%。REST表达量在宫颈鳞状细胞癌中较癌旁组织及正常宫颈组织降低(P<0.05)，KCa3.1表达量在宫颈鳞状细胞癌中较癌旁组织及正常宫颈组织增加(P<0.05)。

2.3 REST在KCa3.1启动区富集及REST与KCa3.1 启动子结合情况 纯化后DNA与DNA marker进行1%琼脂糖凝胶电泳，不同组织超声处理后，DNA片段化，大部分DNA已剪切至200～2000 bp长度，如图1所示。REST在正常组织和癌旁组织中富集量明显高于宫颈鳞状细胞癌组织，如图2。REST与 KCa3.1 启动子结合情况见图3。REST能结合在相应位点，REST在宫颈鳞状细胞癌组织中的富集量比正常宫颈组织下降约60.1%，REST 在宫颈鳞状细胞癌中富集量低于正常宫颈组织和癌旁组织(P均<0.05)。

注：NC为正常宫颈组织，AT为癌旁组织，CC为宫颈鳞状细胞癌组织。

图1不同组织超声处理后1%琼脂糖凝胶电泳

注：NC为正常宫颈组织，AT为癌旁组织，CC为宫颈鳞状细胞癌组织，IgG为阴性对照。

图2REST抗体进行ChIP检测结果

注：NC为正常宫颈组织，AT为癌旁组织，CC为宫颈鳞状细胞癌组织，IgG为阴性对照。

图3qPCR检测不同组织中REST蛋白富集在KCa3.1启动子区的表达量

3 讨论

宫颈鳞状细胞癌是宫颈癌最常见的病理类型[1]。在肿瘤的发生、恶变及转移等过程中，离子通道起重要作用。KCa3.1 是钙激活钾通道家族中的一员，由细胞内Ca2+水平高而激活，可促使K+外流，进而调节细胞膜电位和细胞内钙信号，参与细胞周期的调节和细胞增殖、迁移及浸润[16]，在肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和转移中发挥重要作用[2]。

REST是一种基因沉默转录因子，在非神经元细胞和未成熟的神经细胞中表达。REST全长1 069个氨基酸，氨基端锌指构成REST的DNA结合结构域，可与目标基因调节区域中的抑制元1(REl)位点结合而调控基因转录，REST 的异常表达与多种疾病的发生相关，包括脑缺血、神经退行性疾病、癫痫、肿瘤等[6]。不同类型肿瘤中，REST有不同的作用。正常生理状况下，REST 在非神经细胞中高表达，在分化成熟的神经细胞中几乎不表达或表达量很低。在神经系统肿瘤中REST 表达升高，在非神经系统肿瘤中REST 表达量降低。本研究结果显示，REST在宫颈鳞状细胞癌组织中较正常宫颈组织和癌旁组织中显著降低，提示REST表达降低与宫颈鳞状细胞癌的发生密切相关。

本研究结果显示，宫颈癌组织中 KCa3.1 mRNA的阳性表达率明显高于正常宫颈组织；KCa3.1的表达量在宫颈鳞状细胞癌组织中较癌旁组织及正常宫颈组织增加差异有统计学意义。结合前期研究结果与实验结果提示在宫颈鳞状细胞癌中REST表达与KCa3.1表达相关。

文献报道KCa3.1启动子区含有 2 个串联的 RE1 位点，REST 结合在这两个位点上，负调控 KCa3.1 的表达[13，14]。本研究结果显示，REST能结合在KCa3.1启动子区含有的RE1位点，且REST在宫颈鳞状细胞癌中富集的量较正常宫颈组织和癌旁组织中显著降低。结果提示REST蛋白在宫颈组织中通过与KCa3.1启动子RE1 位点处结合，在正常组织中抑制KCa3.1表达；当REST下调，富集在KCa3.1 启动子区减少，降低了对KCa3.1基因表达的抑制，导致KCa3.1表达上升，从而激活KCa3.1 参与的细胞周期和细胞增殖调控通路，促进宫颈鳞状细胞癌的发生发展。