氢醌染毒对红白血病细胞株K562细胞周期的影响及其机制

赵雪，温缘缘，肖芸，万秀方，李攀登，王永红，郑丹，谢婷婷，张亚莉

(1贵州医科大学医学检验学院，贵阳 550004；2德阳市中西医结合医院；3贵州大学医学院)

苯(Benzene)是一种重要的有机溶剂，被广泛作为化工原料生产染料、黏合剂、室内装修乳漆[1]、农药等。国际癌症研究机构(IARC)早期研究表明苯为第一类致癌物[2]，近年来研究发现苯代谢物氢醌(HQ)是其在体内的主要毒性物质，长期低浓度接触HQ可致血细胞减少、贫血、淋巴瘤等相关血液性疾病[3]。动物试验研究发现长期接触HQ可致实验动物骨髓和血液毒性及肝损伤[4]；课题组前期体外细胞研究结果提示HQ染毒可使白血病细胞株U937细胞 DNA 损伤、增殖抑制并诱导凋亡[5]；有学者表明HQ能使外周血淋巴细胞及淋巴母细胞TK6细胞周期异常，且诱导凋亡[6,7]。细胞周期运转是生命体活动的重要表现，而细胞周期紊乱常伴随异常表现，如细胞凋亡和肿瘤形成等[8]。通常细胞周期的运转受多种细胞周期调节蛋白的调控，如细胞周期蛋白(Cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)及细胞周期蛋白激酶抑制剂(CKI)等，这些蛋白异常改变会对细胞周期正常运行造成一定影响。红系细胞毒性是HQ致骨髓、血液毒性的重要表现之一[9]。目前，关于苯代谢物HQ对红系细胞周期的影响及相关机制仍不明了。2018年3～7月，本研究以红白血病细胞株K562 细胞为体外模型，探究HQ对K562细胞周期的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人白血病细胞株 K562由武汉大学保藏中心提供；氢醌(HQ)购自美国 Sigma 公司；胎牛血清购自美国Gibco 公司；RPMI 1640购自美国 Gibco 公司；细胞周期检测试剂盒购自美国BD公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京 Solarbio 公司；细胞周期蛋白E(CyclinE)、细胞分裂周期基因25A(CDC25A)、细胞周期蛋白依赖激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白A(CyclinA)、p53、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(p21)及增殖细胞核抗原(PCNA)兔源多克隆抗体购自沈阳WanLeibio 公司，GAPDH 兔源多克隆抗体购自南京巴傲德公司,LaminB1鼠抗人单克隆抗体购自美国Proteintech PTGLAB；流式细胞仪、蛋白分析系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 K562 细胞培养与染毒分组 用含10%胎牛血清完全培养基，于5%CO2、37 ℃ 饱和湿度条件下培养K562细胞，待细胞生长至对数期时用于实验。根据课题组前期实验结果[5]，设置空白对照组(0 μmol/L HQ )和HQ染毒低剂量组(15 μmol/L HQ)、中剂量组(30 μmol/L HQ)、高剂量组(60 μmol/L HQ)。取对数生长期的K562细胞，按细胞浓度为2×105/mL接种于六孔板培养，空白对照组、HQ染毒低剂量组、中剂量组、高剂量组分别以HQ终浓度为0、15、30、60 μmol/L处理K562细胞，重复间隔染毒细胞72 h(按照分组以不同浓度HQ处理细胞24 h后，用PBS洗2次，加入完全培养基继续培养24 h后再次用HQ进行相同的处理，如此分别处理共3次即为HQ重复间隔染毒72 h)，收获细胞。

1.3 细胞周期检测 收获已重复间隔染毒72 h 的细胞，制成含1×106个的细胞液，用PBS洗涤1次，2 000 r/min离心5 min，弃上清，滴入冷无水乙醇500 μL固定细胞(2 h至过夜)，4 ℃保存。检测前，用PBS洗去乙醇，加入500 μL PBS重悬细胞，加100 μL RNase A于37 ℃水浴30 min，后加400 μL碘化丙啶于4 ℃避光染色30 min，用流式细胞仪检测细胞周期分布，实验重复3次。

1.4 细胞周期相关蛋白表达检测 收获已重复间隔染毒72 h 的细胞，根据试剂盒说明，提取总蛋白，用BCA法进行蛋白定量，小剂量分装，-80 ℃冻存备用。Western blotting 检测细胞周期相关蛋白CyclinE、CDC25A、CDK2、CyclinA、p53、p21、PCNA(各抗体稀释比分别为1∶750、1∶1 500、1∶1 500、1∶1 500、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000)的表达。电泳-转膜后，5% 脱脂牛奶封闭2 h，按上述各抗体浓度稀释比孵育一抗，4 ℃过夜，次日取出膜条，1×TBST洗膜3次，每次10 min；取各膜条于二抗孵育盒在室温孵育2 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min，ECL显影法，用ImageJ图像软件分析各蛋白条带的灰度值。以GAPDH和LaminB1为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 HQ对K562细胞周期分布的影响 各剂量HQ间隔染毒K562细胞72 h 后，与空白对照组比较，各染毒剂量组G0/G1细胞比例下降，S期比例增加，差异有统计学意义(P< 0.05)，G2/M期细胞差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同浓度HQ对K562细胞周期分布的影响

注： 与空白对照组比较，aP<0.05；与低剂量组比较，bP<0.05。

2.2 HQ对细胞周期相关蛋白表达的影响 与空白对照组比较，低、中、高剂量组CDC25A蛋白的表达量降低(P<0.05)，与低剂量组比较，中、高剂量组CDC25A蛋白的表达量降低(P<0.05)；与中剂量组比较，高剂量组CDC25A蛋白的表达量降低(P<0.05)，CDC25A蛋白随着HQ浓度的增加，表达量呈递减趋势。与空白对照组比较，低剂量组CyclinE蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，中、高剂量组CyclinE蛋白表达量降低(P<0.05)；与中剂量组比较，高剂量组CyclinE蛋白的表达量降低(P<0.05)。与空白对照组比较，低、中剂量组p53蛋白表达量增高(P<0.05)，高剂量组p53蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与低剂量组比较，中、高剂量组p53蛋白表达量降低(P<0.05)，与中剂量组比较，高剂量组p53蛋白表达量降低(P<0.05)。与空白对照组比较，低剂量组PCNA蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，中、高剂量组PCNA蛋白的表达量降低(P<0.05)；与低剂量组比较，中、高剂量组PCNA蛋白的表达量降低(P<0.05)；与中剂量组比较，高剂量组PCNA蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。CDK2、CyclinA和p21蛋白在空白对照组与HQ染毒各剂量组间的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同浓度HQ对细胞周期蛋白相对表达量的比较

注： 与空白对照组比较，aP<0.05；与低剂量组比较，bP<0.05；与中剂量组比较，cP<0.05；与高剂量组比较，dP<0.05。

3 讨论

有研究报道HQ代谢过程中产生的活性氧可使细胞DNA氧化损伤，或与DNA形成加合物造成DNA双链断裂、染色体畸变[10,11]。前期课题组利用HQ染毒K562细胞，发现HQ使K562细胞DNA损伤，且损伤程度呈剂量依耐性[12]。正常情况下细胞有完整的基因损伤修复系统，而内外因素一旦使细胞DNA损伤，细胞随即启动DNA损伤修复机制，在短期效应内使细胞滞留于某些检查点，以使细胞在S期或有丝分裂之前修复受损DNA[13]。当修复完成时，细胞可进行到下一个细胞周期阶段；若细胞无法完成修复，细胞周期可被永久阻断，进而导致细胞衰老或凋亡[14]。然而当细胞周期失调导致不受控制的细胞增殖是肿瘤发生发展最常见的原因[8]。

本研究结果发现，与空白对照组比较，各HQ染毒剂量组G0/G1细胞比例下降，S期比例增加，即HQ使K562细胞阻滞于S期；与空白对照组比较，CDC25A、CyclinE在HQ染毒各剂量组表达量下降，且随HQ浓度增加呈递减趋势，CyclinA、CDK2无显著变化。研究发现Chk1/Chk2 -CDC25A -CyclinE/(A)/-CDK2通路参与由DNA损伤诱导的S期阻滞调控[15]，CyclinE-CDK2与CyclinA-CDK2复合物需要CDC25A激活[13]，CDC25A属于磷酸酶CDC25家族成员，在细胞周期运转调控中有重要意义，是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK1上游的细胞周期正向调控因子。Tu等[16]利用HQ染毒肝细胞，发现CDC25A蛋白泛素化降解，同时检测DNA损伤检测点的相关蛋白发现ATM/ATR及磷酸化Chk2/Chk1的表达均上升，使细胞阻滞于S期。本研究结果提示HQ使参与S期进程的CyclinE蛋白表达量下调，可能是HQ诱导K562细胞发生S期阻滞的原因之一；此外，HQ染毒K562细胞使其DNA受损并且使CDC25A泛素化降解，因而推测HQ使K562细胞DNA损伤可能激活基因损伤修复ATM/ATR-Chk2/Chk1信号通路，导致CDC25A蛋白降解，最终使CyclinE-CDK2和CyclinA-CDK2复合物活化受抑，使细胞发生S期阻滞。

另外，DNA受损可激活ATM/ATR-Chk2/Chk1-p53-p21通路，使p21蛋白表达上调，p21蛋白作为周期负调控蛋白，是CDK抑制蛋白，因此p21上调可影响CyclinE-CDK2复活物活性，从而引发细胞周期阻滞，使受损DNA有充分时间得以修复[15]。本研究结果发现p53蛋白在低、中剂量组有一定程度增高，但p53蛋白下游p21蛋白表达并无上调，提示HQ染毒使K562细胞发生S期阻滞可能与p53-p21通路调控关系不大。此外，本研究发现PCNA在HQ染毒中、高剂量组表达量降低，PCNA是一类只存在于增殖细胞的阶段性表达蛋白质。有研究提示PCNA与S期 CyclinA-CDK2 复合物特异性结合，进而调控细胞周期进程[17]。本研究中PCNA蛋白在HQ染毒中、高剂量组降低可能影响其与CyclinA-CDK2复合物的结合，从而影响S期的进程。研究发现[18]，用白藜芦醇作用结肠癌细胞，使结肠癌细胞发生S期阻滞，同时检测PCNA蛋白发现其表达量上调。可见，不同细胞系在不同药物作用下PCNA蛋白的表达并非相同。

综上所述，HQ致K562细胞周期发生的S期阻滞可能与其下调CDC25A、CyclinE、PCNA蛋白表达有关。本研究所用的红白血病细胞K562具有红系祖细胞特性，在某些诱导剂下能向红细胞增殖分化[9]，因此本研究对阐明HQ引起的血液毒性有一定意义。K562细胞系又为具有高度增殖活性的肿瘤细胞，要探讨HQ对正常造血系统细胞的影响，可利用动物模型及非肿瘤细胞性的细胞进一步研究，从而为HQ致造血损伤机制研究提供实验依据。