柚皮苷和柚皮素对HepaRG细胞核受体蛋白表达的影响

樊威洋，吴灏，王永刚，苏薇薇，何乡，李沛波

(中山大学生命科学学院，广东 广州 510275)

核受体是一种配体依赖性结合后激活的转录因子，属于生物体内转录因子超家族成员之一。核受体能被特异性的配体激活或抑制，参与细胞内转录水平调控，在信号转导、细胞分化、细胞凋亡、细胞代谢和细胞内环境稳定等多种生理过程调控中发挥着重要的作用[1]。肝脏中核受体表达与肝脏疾病密切相关，核受体及其转录协同因子本身或受其调控的靶基因表达的紊乱是导致肝脏代谢失衡及肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝纤维化和肝癌等肝脏疾病发病的重要因素之一[2]。芳香烃受体(AhR)、孕烷X受体(PXR)、组成型雄甾烷受体(CAR)和过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)参与肝脏中多种内源性和外源性物质转运、代谢和清除[3]。有文献表明，AhR基因敲除小鼠会出现肝重量降低、短暂的肝脏微血管脂肪变等发育异常[4]以及肝血管过度增殖[5]等现象；AhR也被认为是包括癌症在内的多种疾病的药物靶标[6]。PXR可通过蛋白磷酸化机制，影响肝癌细胞的形态和迁移能力[7]。CAR的激活能使脂质分解物质代谢基因(CPT1A、HMG-CoA)表达降低，而使脂质合成基因(SCD1)表达增高，从而引发非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)[8-9]。PPARα可通过上调肝脂肪酸结合蛋白的转录表达来增加高密度脂蛋白，并降低血清甘油三酯和低密度脂蛋白，也参与介导的线粒体脂肪酸氧化诱导[10]。

柚皮苷(naringin)是一种二氢黄酮糖苷，由苷元柚皮素(naringenin)在C-7处结合新橙皮糖所形成，主要存在于芸香科柑橘属水果的果皮和果肉中，亦是中药枳实、枳壳、化橘红的主要有效成分之一，柚皮苷进入体内后，小部分可以被小肠直接吸收入血，大部分由肠道微生物水解为柚皮素，继而经肠道吸收入血[11]。文献表明，柚皮苷和柚皮素既能调节肝脏代谢平衡，降低肝脏氧化损伤，也具有抗肝炎、抑制肝癌细胞增殖迁移、抗肝纤维化等作用[12-13]。然而，柚皮苷、柚皮素对肝脏中核受体AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表达的影响尚未见文献报道。本实验采用免疫印迹法，考察柚皮苷、柚皮素对人肝癌细胞HepaRG中AhR、PXR、CAR和PPARα 4种核受体蛋白表达的影响，为研究柚皮苷、柚皮素防治肝脏疾病的机制提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞株 人肝癌HepaRG细胞株，购自上海冠导生物工程有限公司。

1.2 主要药物与试剂 柚皮苷、柚皮素和DMSO(纯度>98%，德国Sigma-Aldrich公司)；利福平(Rifampicin，纯度>98%，上海Aladdin公司)；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海Beyotime公司)； HRP偶连抗兔二抗(美国Promega公司)； Anti-AhR抗体(ab190797)、Anti-PXR抗体(ab85451)、Anti-CAR抗体(ab62590)、Anti-PPARα抗体(ab24509)和重组Anti-GAPDH抗体(ab181602)均购自英国Abcam公司。

1.3 主要仪器 HERAcell VIOS 160i型CO2细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)；Arium mini超纯水系统(德国Sartorius公司)；多孔超微量核酸蛋白分析仪Epoch(美国Biotek公司)；通用电泳电源、小型垂直电泳槽、Trans-Blot Turbo全能型半干蛋白转印仪(美国Bio-rad公司)；Tanon 5200天能化学发光成像系统(中国Tanon公司)。

2 方法

2.1 细胞培养 用完全RPMI-1640培养基(内含10%胎牛血清、1%青链霉素)在37 ℃、5% CO2培养箱中常规贴壁培养人肝癌HepaRG细胞，每隔2 d对细胞换液，细胞生长占据培养底面积80%以上时使用0.25%胰酶消化传代。

2.2 药物配制与细胞处理 称取柚皮苷、柚皮素和利福平，以DMSO溶解并用0.22 μm滤头过滤除菌，配置成终浓度为10、30和100 mmol·L-1的柚皮苷、柚皮素母液和50 mmol·L-1的利福平母液。

取对数生长期的HepaRG细胞，均匀接种于六孔板中培养过夜，分别以含不同浓度柚皮苷(10、30、100 μmol·L-1)、柚皮素(10、30、100 μmol·L-1)或利福平(50 μmol·L-1)的培养基处理24 h或48 h。

2.3 总蛋白提取 药物处理结束，使用RIPA裂解液裂解HepaRG细胞15 min，剧烈涡旋振荡5 min后，于4 ℃条件下以12 000 rcf离心20 min，弃去底部细胞碎片沉淀，收集上清即为HepaRG细胞总蛋白。

2.4 蛋白免疫印迹法

2.4.1 蛋白样品制备和SDS-PAGE凝胶配置 采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定HepaRG细胞总蛋白浓度，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液和PBS稀释总蛋白至1 μg·μL-1，煮沸10 min，上样。

2.4.2 蛋白上样电泳和转膜 每孔的总蛋白上样量为20 μg，80 V恒压电泳10 min后转为250 V恒压电泳25 min。甲醇浸泡活化0.2 μm PVDF膜后，用半干转转膜液浸泡平衡滤纸和PVDF膜30 min，使用Trans-Blot Turbo全能型半干蛋白转印仪2.5 A恒流半干转17 min。

2.4.3 封闭、抗体孵育与检测 转膜结束后用TBST洗膜3次，每次5 min；用5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h；再用TBST洗膜3次，每次15 min；加入含有对应一抗的孵育液，于4 ℃孵育过夜，取膜用TBST洗膜3次，每次15 min；加入二抗孵育液，室温孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次15 min。以ECL高敏发光液孵育10 s，使用Tanon 5200天能化学发光成像系统检测。

3 结果

柚皮苷、柚皮素对人肝癌HepaRG细胞中AhR、PXR、CAR和PPARα这4种核受体蛋白水平的影响结果见图1～4。由图1～2可见，柚皮苷、柚皮素处理人肝癌HepaRG细胞24 h后，与空白组相比，100 μmol·L-1柚皮素显著抑制AhR和PXR蛋白的表达，但对CAR、PPARα蛋白表达没有影响；50 μmol·L-1利福平显著抑制AhR蛋白表达、促进CAR蛋白表达，但对PXR、PPARα蛋白表达没有影响；其余给药处理组的AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表达在统计学意义上没有显著性差异。由图3、4可见，柚皮苷、柚皮素给药处理人肝癌HepaRG细胞48 h后，与空白组相比，100 μmol·L-1柚皮素显著抑制核受体AhR和PXR的蛋白表达，但对CAR和PPARα蛋白表达没有影响；50 μmol·L-1利福平显著抑制核受体AhR蛋白的表达，对CAR、PXR、PPARα蛋白表达没有影响；其余给药组的AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表达在统计学意义上没有显著性差异。

图1 柚皮苷、柚皮素处理HepaRG细胞24 h后核受体AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表达的Western blotting结果

图2 柚皮苷、柚皮素处理HepaRG细胞24 h对核受体AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白相对表达量的比较(n=6)

图3 柚皮苷、柚皮素处理HepaRG细胞48 h后核受体AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表达的Western blotting结果

图4 柚皮苷、柚皮素处理HepaRG细胞48 h后核受体AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白相对表达量的比较(n=6)

4 讨论

AhR作为一种与肝脏疾病密切相关的蛋白，参与生长因子信号传导、凋亡基因表达、细胞周期和细胞因子表达的调控[14-15]，可影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等过程[16]。临床研究表明，AhR在肝癌组织中有高表达现象，而且与癌症的恶性程度相关[17]，抑制AhR表达可能有利于肝癌的防治。PXR可调控多种药物代谢酶和转运体的表达，进而参与肝脏中脂质、糖类物质和临床药物的代谢，影响肝脏疾病的发生发展进程[18]，大多数肝脏疾病中均可见PXR在肝细胞中表达和活性的上调[19-20]。过量服用对乙酰氨基酚(APAP)会激活PXR，靶向调节药物代谢酶CYP450家族的表达，引起APAP药物代谢过程中有毒代谢物N-乙酰对苯醌亚胺的大量积累，进而诱导氧化应激、DNA损伤和线粒体功能受损[21]。此外，利福平与异烟肼合用时，通过激活PXR来促进氨基乙酰丙酸合成酶Ⅰ的表达，增加胆汁中血红素前体原卟啉Ⅸ的产生，从而造成肝损伤[22]。因此，抑制PXR表达在肝脏疾病药物筛选与治疗中具有潜在价值。

Zhou等[23]研究表明，柚皮苷能通过减轻脂质积累、减少氧化应激和凋亡来抑制酒精诱导的斑马鱼肝损伤和脂肪变性。Arul等[24]研究表明，柚皮素能抑制N-亚硝基二乙胺诱导大鼠肝癌的发生和前期病变。Ahmed等[25]研究表明，柚皮苷和柚皮素能显著改善APAP引起的肝组织细胞质空泡化和炎性细胞浸润，具有增强抗氧化防御并抑制炎症和细胞凋亡的作用。

本实验结果表明，100 μmol·L-1柚皮素能显著下调HepaRG细胞AhR、PXR的蛋白表达，提示柚皮素可能可以通过抑制AhR和PXR的表达来发挥抗肝癌和肝损伤的作用。但是，在本实验中，柚皮苷对AhR、PXR、CAR和PPARα这4种核受体蛋白均无显著性影响，可能是因为柚皮苷极性较大而无法通过HepaRG细胞膜。本研究从核受体方面为柚皮苷、柚皮素防治肝脏疾病提供了一定的药理学依据。