ADCY9基因介导吉西他滨肺腺癌耐药的系统生物学研究

王桂平，梁杰聪，张彦焘 ，李智斌

(1.广州卫生职业技术学院药学系，广东 广州 510180；2.广州市妇女儿童医疗中心外科，广东 广州 510623)

肺腺癌是常见的肺癌类型，约占原发性肺癌的40%，严重危害人类健康。手术切除仍是最有效的早期肺腺癌治疗手段，但不幸的是，大多数肺癌发现时均进入晚期，已丧失手术最佳治疗时间。近年来，靶向药物如吉非替尼、克唑替尼等明显改善肺癌的生存率，然后，由于大多数已为晚期肿瘤患者，以及某些患者体内存在不同的基因突变及遗传异质性致使化疗耐药产生，目前数据显示化疗的有效率仅为20%～40%，肺癌总体生存率仍然非常低[1]。

吉西他滨(Gemcitabine)是一种新型胞嘧啶核苷衍生物，也是目前晚期(Ⅳ期)肺腺癌等非小细胞肺癌的一线用药。随着吉西他滨在临床的广泛应用，肿瘤耐药性也成为制约吉西他滨临床疗效的关键问题[2]。目前，已发现ENT1、RRM1及CDA等基因可能是导致吉西他滨耐药性产生的重要因子，但这些因子是否可以作为个体化治疗生物标志物，仍需进一步研究。肿瘤化疗耐药性产生机制相当复杂，涉及较多基因及生物信号转导过程。本研究中，我们将基于TCGA、GEO数据平台，采用系统生物学模式，构建吉西他滨肺腺癌耐药蛋白调控网络，从调控网络中挖掘可能的耐药因子，寻找具有临床应用前景的个体化治疗标志物。

1 材料与方法

1.1 基因表达谱数据集获取及差异基因表达分析 从NCBI的GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中获得基因表达谱数据集(No:GSE6914)。该数据集采用GPL96芯片平台([HG-U133A]Affymetrix Human Genome U133A Array)，包括20个配对样本，本研究选择其中的8个样本进行研究，即4个Calu3正常细胞样本和4个gemcitabine耐药Calu3细胞样本。采用dChip分析软件进行差异基因分析，获得gemcitabine耐药的差异表达基因(DEGs),具体操作方法按dChip操作指南进行(http:// www.dchip.org )，2-fold change的基因被选择为差异表达基因。

1.2 差异表达基因的go和pathway聚类分析[3]采用DAVID在线分析软件(https://david.ncifcrf.gov/)对差异基因进行基因注释、生物信号通路功能聚类分析，选择P<0.05,且富聚数量基因≥10的聚类结果。

1.3 蛋白质相互作用网络构建及hub基因发现[4]采用STRING软件(https://string-db.org/)构建gemcitabine耐药蛋白质相互作用网络，然后，应用cytohubb APP 分析蛋白质相互作用网络，获得排列前10位的10个hub基因。

1.4 hub基因的在肿瘤组织中表达分析[5]Oncomine数据库已经收集了729个基因表达数据集，90 000多个癌症组织和正常组织的样本数据，是目前世界上最大的癌基因芯片数据库和整合数据挖掘平台，可用于比较主要癌症类型和各自正常组织的差异表达分析，也可以用于探索各种癌症亚型以及基于临床和病理学的分析。本项目应用Oncomine 数据库，比较hub基因在肺腺癌等肿瘤与相应正常组织中的表达水平。

1.5 ADCY9基因表达及预后分析 基于Oncomine 数据库，系统分析ADCY9在肺腺癌与癌旁正常组织中的表达差异；采用GEPIA分析工具(http://gepia.cancer-pku.cn)，分析ADCY9 mRNA表达水平与肺腺癌总体生存率的关系。

1.6 ADCY9共表达基因分析 基于GSE6914数据集中gemcitabine耐药和敏感的样本，通过Oncomine数据库分析ADCY9的共表达基因，并采用DAVID分析工具对共表达基因进行基因与信号通路的聚类分析。

2 结果

2.1 吉西他滨诱导肺腺癌耐药的差异表达基因 本研究采用dChip分析软件对GSE6914数据集中8个样本进行差异基因分析，最终获得差异表达基因391个，其中上调基因80个，下调基因311个(数据未提供)。信号通路富集分析显示，RAP1、RAS及PI3K-AKT等通路显著下调(见图1)；而基因生物学功能富集显示，正向调控细胞转移、细胞增殖等过程基因表达显著上调，而炎症反应相关免疫因子、正向调控钙离子活动及细胞外间隙等生物过程中的基因则显著下调表达(见图2)。

图1 吉西他滨肺腺癌耐药差异表达基因KEGG通路富集分析

图2 吉西他滨肺腺癌耐药差异表达基因GO富集分析

2.2 吉西他滨诱导肺腺癌耐药的hub基因筛选 吉西他滨诱导的肺腺癌耐药差异表达基因，经基因生物功能及信号通路富集后，将显著富集基因输入STRING软件进行蛋白质相互作用网络构建，获得162个结点，126条边,平均节点度为1.56，PPI网络富集具有显著性(P=0.019 5)。应用cytohubba APP对网络进行分析，获得排列前10的hub基因，即BDKRB2、BDKRB1、POMC、ADCY9、SSTR3、CXCR1、CCL13、PTGER3、 HRH3 及INSL5(如图3)。

图3 吉西他滨耐药肺腺癌蛋白质相互作用网络及hub基因

2.3 hub基因在肺腺癌及其他肿瘤组织中的表达分析 基于TCGA和Oncomine库分析，结果显示10个hub基因在肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、白血病等人类肿瘤中主要以下调表达为主，其中，ADCY9、CCL13及OTGER3基因在肺腺癌存在明显表达下调，而其他hub基因则出现较大的肿瘤异质性，其表达情况不明确(见图4)。

2.4 ADCY9基因在肺腺癌中表达及预后分析 在所有hub基因中，ADCY9的表达与肺腺癌关系最为显著，该基因在肺腺癌中明显表达下调，生存分析也发现ADCY9基因高水平表达可降低肺腺癌总体死亡风险(log rankP=0.014)，如图5所示。

2.5 ADCY9基因介导吉西他滨肺腺癌耐药机制 ADCY9基因可能是影响肺腺癌发生进展的重要因子，该基因的异常表达是否与吉西他滨肺腺癌耐药有关。ADCY9基因在吉西他滨肺腺癌耐药中的表达情况分析结果显示(见图6)：ADCY9基因在吉西他滨耐药的肺腺癌样本中表达下调，而对吉西他滨敏感的肺腺癌样本中则上调表达。基因共表达分析发现，ADCY9基因与SMAD6存在相似的表达，相关性分析也显示ADCY9与SMAD6基因具有显著相关性(P=5.6×10-27,R=0.44，见图7)。对获得的ADCY9共表达基因进行基因功能与信号通路聚类分析发现，共表达基因主要涉及肌醇磷酸化、MAPKK活化、钙离子负性转运、蛋白磷酸化负性调控、细胞生长负性调控等生物学过程，以及Rho蛋白及G蛋白信号等信号通路(见图8)。

图4 hub基因在人类常见肿瘤中的表达分析

1.吉西他滨耐药组；2.吉西他滨敏感组

图7 ADCY9与SMAD6基因相关性分析结果

图8 ADCY9共表达基因KEGG 通路及基因GO富集结果

3 讨论

吉西他滨是一种新型人工合成嘧啶核苷类似物，主要通过抑制DNA，干扰癌细胞的复制产生抗肿瘤效应，是晚期非小细胞肺癌等肿瘤治疗的重要药物。然而，较多的患者仍然对其产生了耐药性，最终导致治疗失败，因此，探索吉西他滨耐药的分子机制，一直以来是科学家研究的重点。本研究获得吉西他滨耐药的肺腺癌差异表达基因谱，该表达谱主要以下调基因表达(311个下调基因)为主，主要表现为RAP1、RAS及PI3K-AKT、钙离子活动正向调控等通路显著下调表达。接着，基于生物过程及信号通路富集结果，我们构建了吉西他滨耐药的蛋白质相互作用网络，并获得BDKRB2、BDKRB1、POMC、ADCY9等10个hub基因，其中ADCY9基因在肺腺癌组织中明显下调表达，并且与肺腺癌的预后有关。

ADCY9基因主要催化信号分子cAMP的形成，其作用主要受 GPCRs、钙等调控。ADCY9基因在肺腺癌组织中明显低表达，该基因是否也与吉西他滨所致肺腺癌耐药有关？本研究进一步分析ADCY9基因与吉西他滨耐药的关系，发现ADCY9基因在吉西他滨耐药的肺腺癌样本中明显低表达，而在吉西他滨敏感的肺腺癌样本中则高表达，此说明ADCY9基因的低表达可能与吉西他滨耐药相关。为分析ADCY9基因介导引起吉西他滨耐药的机制，我们获得了ADCY9基因的共表达基因，发现该基因与SMAD6基因存在相似的表达，并且相关性分析也显示ADCY9与SMAD6基因具有显著相关性(P=5.6×10-27,R=0.44)。SMAD6作为一种重要的信号转导因子和转录调控因子，主要负性调控TGF-β信号通路的激活。TGF-β信号通路具有抑癌和促癌双重作用，近年来的研究表明，该信号通路与肿瘤耐药性密切相关，MED12蛋白的缺失导致TGF-β信号通 路活化，从而导致癌细胞对TKIs类耐药性产生，而TGF-β抑制剂联合TKIs药物，则可对抗癌细胞的TKIs耐药[6-7]。此外，TGF-β信号通 路还可通过上调PKCa的表达增强耐药，也可通过诱导ET-1、OCT4等因子的表达，促进EMT而产生耐药[8]。综上，我们推测ADCY9基因的低表达可能是介导吉西他滨肺腺癌耐药的重要分子之一，低表达的ADCY9基因是否也是通过活化TGF-β信号通 路产生耐药，此需要进一步的实验证实。

为进一步明确ADCY9介导吉西他滨肺腺癌耐药的分子机制，本项目对获得的共表达基因，进行基因功能与信号通路聚类分析，结果发现ADCY9基因的功能可能涉及肌醇磷酸化、放射反应、MAPKK活化、钙离子负性转运、蛋白磷酸化负性调控、细胞生长负性调控等生物学过程，以及Rho蛋白及G蛋白偶联受体(GPCR)等信号通路。上述共表达基因聚类生物过程事件中，许多均与肿瘤耐药有关，例如MAPKK(Raf)的激活可削弱化疗药的抗肿瘤 效果,成为产生耐药的一个重要原因[9]；Rho蛋白家族中RhoA、RhoB及RhoE等均与肿瘤耐药的产生有关[10-11]； GPCR则是目前最为成功的药物靶标家族，目前40%以上的上市药物以GPCR为靶点，PI3K/Akt 是GPCR下游的主要效应因子，而PI3K/Akt 信号通路 可通过多种机制引起肿瘤的多药耐药[12-13]。基于上述共表达基因分析，我们推测吉西他滨肺腺癌耐药机制可能与Rho蛋白、G蛋白偶联受体介导的MAPKK(Raf)、PI3K/Akt等信号通路相关，ADCY9基因的下调表达在Rho、Raf、PI3K/Akt等因素介导的耐药机制中究竟扮演什么角色？此需要进一步的实验证实。