清胰颗粒特征图谱及稳定性研究

欧水平，郑小翠，王森,3，陈灵 ，王玉和，任丽

(1.遵义医科大学附属医院药剂科，贵州 遵义 563000；2.遵义医科大学药学院，贵州 遵义 563000；3.毕节市第一人民医院药学实验室，贵州 毕节 551700)

清胰汤为遵义医科大学附属医院临床经验方，现已记载于《古今名方》，由大黄、赤芍、栀子、木香、厚朴、醋元胡、丹皮及芒硝8味药材组成，具有疏肝利胆、清热泻火、止痛通便的功效[1]。临床应用已有五十多年的悠久历史，疗效确切，能显著提高急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)及重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)的治愈率[2-3]，具有抑制胰酶活性、降低血清淀粉酶、清除肠道内毒素等作用[4-6]。临床长期以汤剂给药，虽然汤剂与中医辨证诊治、随症加减的原则一致，但汤剂体积大，易腐坏，携带不便，关键是质量难以控制。制备成颗粒剂既保持了汤剂吸收快、作用迅速的优点，又克服了汤剂的各种缺点[7]。故本文在前期研究总结的基础上[1]，建立清胰颗粒的特征图谱，进而根据《中国药典》2015年版(四部)[8]通则“0104”项下有关规定，建立清胰颗粒的质量标准，再按照通则“9001”项下相关要求，对清胰颗粒进行加速和长期稳定性试验，为清胰颗粒的生产及质量控制提高参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Sartorius BT125D 分析天平(Sartorius 科学仪器有限公司)；TD5M低速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；ZF-7型暗箱三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)；DL-820D超声仪(上海之信仪器有限公司)；DURA12型超纯水机(泽拉布仪器科技有限公司)。

1.2 试药 大黄素、大黄酸、丹皮酚(中国食品药品检定研究院，批号分别为110756-201512、110757-201607、110708-201407，纯度均>99%)；延胡索对照药材(中国食品药品检定研究院，批号为120928-201609)；栀子苷、芍药苷、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、延胡索乙素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚(成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为MUST-17020401，MUST-16041901，MUST-17031102，MUST-17020205，MUST-16050705，MUST-16041601，MUST-17022720，MUST-17030605，MUST-17030603，MUST-17030622，纯度均>99%)；甲醇、乙腈(色谱纯，瑞典Oceanpak公司)；清胰颗粒(自制)；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 清胰颗粒制备 称取处方量各药材，加入10倍量65 ℃ 水浸泡30 min(除芒硝外)，煎煮3次，每次20 min，过滤，合并3次滤液[4]，取适量溶解芒硝，55 ℃ 减压浓缩至稠浸膏，70 ℃ 减压干燥，干浸膏粉碎过80目筛，即得清胰浸膏粉。称取浸膏粉与辅料，按一定比例混匀，加入一定量浓度的乙醇，制得适宜软材，挤压过筛制粒，干燥0.5 h，过1号与4号筛整粒即得。空白颗粒的制备方法同清胰颗粒，但不加入清胰浸膏粉。

2.2 清胰颗粒特征图谱的建立

2.2.1 色谱条件 UItimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，洗脱程序：0～13 min，15%→28% B；13～15 min，28%→47% B；15～55 min，47%→56% B；55～60 min，56%→80% B；60～65 min，80%→80% B；柱温：30℃ ；流速：1 mL·min-1，检测波长：237 nm，进样量10 μL。

2.2.2 溶液配制 分别精密称取各对照品适量，制得栀子苷、芍药苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯的含量依次为94.63、45.56、46.57、6.92、23.53、19.30、7.54、10.58、30.93、30.99、18.41、18.52 μg·mL-1的混合对照品溶液。精密称定清胰颗粒0.5 g，加5 mL甲醇，超声(400 W)30 min。过0.22 μm 滤膜即得供试品溶液，同法制得空白颗粒溶液。

2.2.3 专属性考察 分别取空白颗粒、混合对照品溶液、供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，得色谱图(见图1)，辅料对各成分测定无干扰，且分离度良好，此方法专属性良好。

A.空白颗粒；B.混合对照品；C.清胰颗粒 1.栀子苷；2.芍药苷；3.丹皮酚；4.芦荟大黄素；5.大黄酸；6.大黄素；7.和厚朴酚；8.木香烃内酯；9.去氢木香烃内酯；10.厚朴酚；11.大黄酚；12.大黄素甲醚

2.2.4 精密度试验 取同一供试品溶液，在色谱条件下连续进样6次，记录并计算得各成分峰面积RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验 取同一批号清胰颗粒6份，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，按色谱条件进样测定，记录并计算得共有峰峰面积比值的RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于进样环境下0、2、4、8、15、24 h进行测定，记录并计算得峰面积RSD均小于3%，表明各成分进样环境下24 h内稳定。

2.2.7 样品特征图谱测定 按供试品溶液制备方法制备3批清胰颗粒溶液，取混合对照品和供试品溶液，进样分析，记录色谱图。使用国家药典委员会的 “中国指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，评价3批清胰颗粒的 HPLC 图谱，通过保留时间和紫外吸收光谱图比对，确认12个已知成分共有峰(见图2)。以3批样品0个月的指纹图谱生成参照图谱，参照图谱与3批样品的图谱相似度均大于0.999，表明各批样品与对照指纹图谱有良好的相似性。

图2 清胰颗粒特征图谱(0.混合对照品；1～3.从下往上代表3批清胰颗粒在加速试验0、1、3月的图谱)

2.3 清胰颗粒的稳定性研究

2.3.1 加速试验 取清胰颗粒3批样品，在相对湿度75%±5%，(40±2)℃条件下放置6个月，分别于 0、1、2、3、6 月定期取样测定，对其性状、TLC定性鉴别、粒度、水分、溶化性、特征图谱、含量测定(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)项目进行考察，含量测定的色谱条件同“2.2.1”项下。方法学结果表明：溶剂、辅料及其他药味对蒽醌类成分测定无干扰，各成分分离度良好，专属性良好；5个成分均在2.5～40.0 μg·mL-1范围内线性关系良好；精密度及重复性试验所得的5个成分含量的RSD均小于3%；稳定性试验结果表明供试品溶液室温条件下24 h内稳定；加样回收率试验结果表明芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均回收率分别为100.42%、97.82%、97.54%、98.03%、99.95%，RSD为 2.55%、1.73%、1.49%、2.15%、1.47%。加速稳定性试验结果见表1，在6个月加速试验期，清胰颗粒的各项指标均符合规定。

表1 清胰颗粒加速稳定性试验结果

2.3.2 长期试验 将清胰颗粒3批样品，在相对湿度60%±10%，(25±2)℃条件下放置12个月，分别于0、3、6 、9、12月定期取样测定，对其性状、TLC定性鉴别、粒度、水分、溶化性、特征图谱、含量测定项目进行考察。见表2，结果表明，在12个月时间内，清胰颗粒的性状、粒度、含量测定等指标均符合规定。

表2 清胰颗粒长期稳定性试验结果

3 结论与讨论

本文建立了清胰颗粒的特征图谱，按《中国药典》2015年版规定，对清胰颗粒外观性状、水分、粒度等进行检查。采用TLC鉴别了本品中延胡索乙素，方法简单快速，可作为本品的专属鉴别。清胰颗粒所含成分复杂，包括栀子苷、木香烃内酯、芍药苷、丹皮酚、延胡索乙素、蒽醌类及厚朴酚等成分，其中大黄作为君药，其蒽醌类最为重要，文献报道具有较好抗炎作用，因此，采用HPLC方法，对颗粒中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚进行含量测定。建立清胰颗粒特征图谱测定方法，其特征图谱中测出与对照品溶液中的12个(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、栀子苷、芍药苷、丹皮酚、去氢木香烃内酯、木香烃内酯、和厚朴酚及厚朴酚)主要特征峰保留时间相对应的色谱峰。含量测定和特征图谱方法简便、稳定、准确，有利于很好的控制本品质量。

本文进行初步稳定性研究，在加速试验和长期试验条件下，分别放置6个月和12个月，与0月相比，其性状、水分、粒度、溶化性检查、TLC鉴别、特征图谱、含量测定等均符合规定，表明药物是稳定可控的。由于时间关系，只做了12个月的长期稳定性试验，后期将留样继续进行18个月或更长时间的长期稳定性考察，以此观察有效期，为清胰颗粒的生产及临床应用提供科学依据。