感冒清片中南板蓝根定性分析方法的研究

乔莉，杨志业，李华，周颖仪，刘潇潇

(广东省药品检验所，广东 广州 510663)

感冒清片是常见的治疗风热感冒的中西药复方制剂，由南板蓝根、大青叶、岗梅、金盏银盘、山芝麻、穿心莲叶、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、盐酸吗啉胍组方而成。其中对乙酰氨基酚具有解热镇痛作用；氯苯那敏能减轻微血管扩张和降低毛细血管通透性，能缓解流涕、流泪、打喷嚏的症状；盐酸吗啉胍对多种病毒(如甲、乙型流感病毒，副流感病毒等)有抑制作用。中药南板蓝根和大青叶性寒、味苦，均具有清热解毒，凉血消斑之功效；金盏银盘具有清热解毒，散瘀活血之功效[1]；岗梅具有清热解毒，生津止渴，利咽消肿，散瘀止痛之功效[2]；山芝麻具有解表清热，解毒消肿之功效[3]；穿心莲叶具有清热解毒，凉血，消肿之功效[4]。处方药味中西合璧，协同发挥药效，常用于感冒引起的发烧、头痛、鼻塞流涕、喷嚏、咽喉肿痛、全身酸痛等症状[5]。但现行质量标准收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第十九册(WS3-B-3716-98)，检验项目仅包含了一个化学反应、马来酸氯苯那敏和盐酸吗啉胍的薄层色谱鉴别、对乙酰氨基酚的液相色谱鉴别和含量测定，缺乏对其中6味中药的专属性鉴别和有效成分的含量测定。特别是处方中的主要药味南板蓝根由于其生长年限长，野生资源匮乏，人工种植量少，远远不能满足市场需求，导致药材市场流通中出现了以同科植物球花马蓝[StrobilanthesPentstemonoides(Nees)T.Ander]、广西马蓝(S.guangxiensisS.Z.Huang)、少花马蓝(S.oliganthusMiq.)和疏花马蓝[S.divaricatus(Nees)Ander]等作为南板蓝根混用的现象[6]。因此，建立感冒清片中南板蓝根的定性分析方法对完善其质量标准、保证其有效性具有积极的意义。

南板蓝根为爵床科植物马蓝[BaphicacanthusCusia(Nees) Bremek.]的干燥根茎和根，为抗病毒的常用中草药，广泛分布于我国华南、华东及西南地区，其化合物主要有生物碱类、黄酮类、有机酸类、苷类、甾醇类、五环三萜类等[7]。现行质量标准收载于《中国药典》2015年版(一部)，检验项目包括：横切面的显微鉴别；以靛蓝、靛玉红对照品为参照的薄层鉴别；水分、总灰分的检查；浸出物的测定。有文献报道以靛蓝、靛玉红作为专属性指标成分能有效地对马蓝和其混淆品球化马蓝、广西马蓝、少花马蓝和疏花马蓝进行鉴定[8-9]，但由于本品处方药味大青叶亦含有靛蓝和靛玉红[10]，因此该方法不适用于本品中南板蓝根的定性分析。另有Gu等[11-12]从南板蓝根中分离得到2-苯并噁唑啉酮，该化合物的含量较高，且具有抗流感病毒(H1N1)的活性，与南板蓝根的现代药理作用基本相符。本研究以此为依据，首先通过对25批次的南板蓝根正品、伪品和混淆品样本进行比较，结果显示2-苯并噁唑啉酮为南板蓝根的专属性化学成分；然后以2-苯并噁唑啉酮作为感冒清片中南板蓝根药味的指标成分，建立定性分析方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20AT液相色谱仪(包括四元泵、柱温箱、SPD-M20A二极管阵列检测器、自动进样器、Lab Solution色谱数据处理软件，美国安捷伦公司)；1290 Infinity超高效液相色谱仪(包括四元泵、柱温箱、G4212A二极管阵列检测器、自动进样器，美国安捷伦公司)；6540 UHD Accurate- Mass- Q- TOF高分辨四级杆-飞行时间质谱仪(配ESI源、Mass Hunter Acquisition色谱工作站和Qualitative Analysis数据处理软件，德国优莱博公司)；Julabo E19恒温水浴箱(德国赛多利斯仪器系统有限公司)；CP225D(d=0.01 mg)、CP224S(d=0.1 mg)电子天平(德国艾尔玛公司)；S300H超声波清洗仪。

1.2 试药 对照药材南板蓝根(批号：120971-201105和120971-201306)、对照品靛玉红(批号：110717-200204)均购于中国食品药品检定研究院，对照品2-苯并噁唑啉酮(批号：C10040722)购于上海麦克林生化科技有限公司。市售南板蓝根正品、南板蓝根伪品、板蓝根样品共25批次(样本编号为YC001～YC025)，经广东省药品检验所中成药室/中药材(饮片)室杨志业主任药师采用生物分子测序的方法鉴定：其中YC001～YC005为南板蓝根伪品；YC006为十字化科植物菘蓝(IsatisindigoticaFort.)的干燥根；YC007～YC025为爵床科植物马蓝[BaphicacanthusCusia(Nees) Bremek.]的干燥根茎和根。感冒清片样品共56批次涉及9家生产企业，均为2017年国家药品抽验计划抽检样品，详见表1。感冒清片的标准制剂、缺南板蓝根阴性样品，均按感冒清片工艺制法在实验室模拟制备。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 取2-苯并噁唑啉酮对照品适量，加甲醇-二氯甲烷(8∶2)制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液 取本品8片，除去包衣，研细，置锥形瓶中，加二氯甲烷50 mL，60 ℃水浴回流90 min，放冷，滤过，用二氯甲烷分次洗涤滤渣及容器，合并滤液及洗液，蒸干，残渣加甲醇-二氯甲烷(8∶2)的混合溶液使溶解，并转移至5 mL量瓶中，加甲醇-二氯甲烷(8∶2)的混合溶液稀释至刻度，即得。

2.1.3 南板蓝根溶液 取南板蓝根药材粉末(过5号筛)约2 g，按“2.1.2”项下的方法操作，即得。

2.1.4 南板蓝根水煎浸膏提取溶液 取南板蓝根药材粉末(过5号筛)约2 g，加水煎煮2次，第一次2 h，第二次1 h，过滤，合并滤液，浓缩至适量，加无水乙醇使含醇量达50%以上，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至近干(按感冒清片工艺制法)，按“2.1.2”项下的方法操作，即得。

2.1.5 南板蓝根阴性样品溶液 取南板蓝根阴性样品适量(相当于感冒清片8片的量)，按“2.1.2”项下的方法操作，即得。

2.2 HPLC-DAD法初筛

2.2.1 色谱条件 采用Agilent Ecilpse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；以甲醇为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱(0～40 min，20%A；40～60 min，20%A→70%A；60～80 min，70%A)；流速为1 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为271 nm，并进行200～400 nm全波长扫描；进样量为20 μL 。

2.2.2 仪器精密度试验 精密吸取同一供试品溶液(标准制剂)，按“2.2.1”项下的色谱条件，连续进样6次，记录峰面积。结果：2-苯并噁唑啉酮峰面积的RSD为0.3%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.3 专属性试验

2.2.3.1 南板蓝根药材中2-苯并噁唑啉酮的专属性试验 取收集的南板蓝根正品、伪品和混淆品样本共25批次和南板蓝根对照药材2批次，分别按“2.1.3”和“2.1.4”项下的方法操作，制成南板蓝根对照药材、正品、伪品和混淆品溶液和各自的水煎浸膏提取溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件进行测定，结果：样本YC001～YC006的溶液和其水煎浸膏提取溶液均未检出2-苯并噁唑啉酮；样本YC007～YC025的溶液、对照药材的溶液和其水煎浸膏提取溶液均检出2-苯并噁唑啉酮。说明2-苯并噁唑啉酮为南板蓝根的专属性化学成分。

2.2.3.2 感冒清片制剂的专属性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液与南板蓝根阴性样品溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1，表明缺南板蓝根阴性样品无干扰。

A.对照品；B.供试品；C.缺南板蓝根阴性样品 1.2-苯并噁唑啉酮

2.2.4 重复性试验 取同一批样品(标准制剂)，研细，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按 “2.2.1”项下色谱条件测定，结果：2-苯并噁唑啉酮单位峰面积的RSD为0.7%(n=6)，表明本方法重复性良好。

2.2.5 稳定性试验 取同一批样品(标准制剂)，按 “2.1.2”项下的方法制成供试品溶液，精密吸取10 μL，按 “2.2.1”项下的色谱条件，分别在0、2、4、8、12、18和24 h，注入液相色谱仪，记录峰面积。结果：2-苯并噁唑啉酮峰面积的RSD为0.2%(n=6)，表明样品在24 h内基本稳定。

2.2.6 检测限 用2-苯并噁唑啉酮对照品溶液进行逐级稀释，按“2.2.1”项下的色谱条件测定，结果得检测限为2.142 ng(S/N=3.3)。

2.2.7 样本测定结果的判定 分别取“2.1.1”项下对照品溶液和“2.1.2”项下的供试品溶液，按“2.2.1” 项下的色谱条件，记录色谱图：若供试品色谱中呈现与2-苯并噁唑啉酮对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰，且相应的色谱峰在200～400 nm波长范围的紫外吸收光谱相同，认定为阳性样本。若供试品色谱中未呈现与2-苯并噁唑啉酮对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰，或供试品色谱中呈现与2-苯并噁唑啉酮对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰，但相应的色谱峰在200～400 nm波长范围的紫外吸收光谱与对照品不相同，则需要采用超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间-质谱法确认。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS法确证

2.3.1 液相色谱条件 采用Agilent Poroshell 120 EC- C18(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)色谱柱，以乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～20 min，20%A→60%A；20～25 min，60%A)，流速为0.2 mL·min-1，检测波长为271 nm，柱温为30 ℃，进样量2 μL

2.3.2 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)，负离子模式采集数据；离子源温度为150 ℃；毛细管电压为3.5 kV；雾化器压力为20 psi；干燥气流速为8 L·min-1；干燥气温度为350 ℃；锥孔电压65 V；扫描范围为m/z：50～300；碰撞能为30 V。

2.3.3 检出限 用2-苯并噁唑啉酮对照品溶液进行逐级稀释，按“2.2.1”项下的色谱条件测定，结果得检测限为0.16 ng(S/N=3.0)。

2.3.4 样本测定结果的判定 分别取“2.1.1”项下对照品溶液和“2.1.2”项下的供试品溶液，按“2.3.1”和“2.3.2”项下超高效液相串联质谱条件，记录一级质谱图(见图2)，2-苯并噁唑啉酮在负离子模式下，保留时间为7.799 min，获得m/z:134.024 4的[M-H]-分子离子峰。若以质荷比(m/z)134.02提取的供试品离子流色谱中，呈现与2-苯并噁唑啉酮对照品色谱保留时间相同的色谱峰，且相应的色谱峰一级质谱相同，认定为阳性样本。若以质荷比(m/z)134.02提取的供试品离子流色谱中，未呈现与2-苯并噁唑啉酮对照品色谱保留时间相同的色谱峰，或供试品色谱中呈现与2-苯并噁唑啉酮对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰，但相应相应的色谱峰一级质谱不相同，则认定为阴性样本。

A.对照品；B.供试品

2.4 结果 按拟定的南板蓝根定性分析方法，对2017年国家药品抽验计划抽检的9家生产企业共56批次感冒清片样本进行了测定，结果仅19批次的样本检出了2-苯并噁唑啉酮，检出率为34%，详见表2。

表2 样品的检测结果

3 讨论

3.1 样品前处理条件的选择 提取溶剂的选择上比较了无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯和二氯甲烷，结果以二氯甲烷为提取溶剂时提取的效果最佳。提取方法的选择上比较了超声提取15、30、60 min和水浴回流提取30、60、90、120 min，水浴回流提取较超声提取更完全，且水浴回流90 min后，测得2-苯并噁唑啉酮的含量无明显增长，故选择水浴回流提取的方式。

另外对2-苯并噁唑啉酮的热稳定性进行了考察，发现该成分在80 ℃以上的环境中含量会有所降低，但是并未影响处方工艺条件下制得的本品及标准制剂的检测结果。为了避免高温条件对2-苯并噁唑啉酮的热稳定性影响，提取、干燥等前处理过程均采用温度在80 ℃以下的方法。

3.2 色谱条件的选择 流动相选择上比较了乙腈-水系统和甲醇-水系统，结果在采用甲醇-水系统时样品中2-苯并噁唑啉酮能达到基线分离的要求。检测波长的选择上，对照品溶液在200～400 nm范围内经二极管阵列检测器扫描，结果2-苯并噁唑啉酮在223、271 nm处有最大吸收，且在271 nm处色谱基线较平稳，杂质峰较少，故选择271 nm作为检测波长。另外曾使用3个不同品牌的色谱柱，即Agilent Ecilpse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Phenomenex Luna C18(2)(4.6 mm×250 mm，5 μm)、资生堂 MGⅡ C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm)进行试验，结果均能满足分离要求，且2-苯并噁唑啉酮的保留时间适中，峰形佳。

3.3 检测方法的选择 HPLC-DAD法检出限为2.142 ng，UPLC-Q-TOF-MS法检出限为0.16 ng。由于HPLC-DAD法的灵敏度较UPLC-Q-TOF-MS法低，当采用HPLC-DAD法出现阴性结果时，建议采用UPLC-Q-TOF-MS法进行结果确证。

3.4 小结 本研究建立了感冒清片中南板蓝根的定性分析方法，该方法专属性强，灵敏度高，结果准确可靠，为感冒清片的质量控制提供了技术支持，同时为南板蓝根的质量控制奠定了研究基础。