瓜蒌提取物的化学指纹特征及5种成分的定量分析

邹纯才，吕文雅，鄢海燕，洪国君，王莉丽

瓜蒌为葫芦科植物栝楼（Trichosanthes kirilowiiMaxim.）或双边栝楼（Trichosanthes rosthorniiHarms.）的成熟阴干果实［1］，其皮称为瓜蒌皮，子称为瓜蒌子.由于瓜蒌不易阴干，有关文献以瓜蒌皮：瓜蒌子（35：65）用于胸痹心痛等疾病的治疗［2］.本研究在对瓜蒌提取溶剂、瓜蒌皮与瓜蒌子配伍比例考察的基础上［3，4］，制备瓜蒌提取物，可为开发现代新剂型如滴丸、微丸奠定基础［5，6］.本实验对瓜蒌提取物的化学指纹图谱及尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷、鸟苷进行定量分析，以期为瓜蒌提取物的质量控制提供理论依据.

1 实验仪器及材料

1.1 实验仪器

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司），FA2004型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司），DZF-6030A型真空干燥箱（上海恒一科技有限公司）.

1.2 实验材料

瓜蒌提取物（皖南医学院药物制剂及其质量控制课题组制备，批号：lwy170601～lwy170610）；尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷、鸟苷（国药集团化学试剂有限公司，批号分别为：20150417、20140928、20150707、20140522、20150526）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯.

2 方法

2.1 溶液的制备

（1）对照品溶液的制备.取尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷、鸟苷对照品适量，精密称定，置于10mL容量瓶中，以15%甲醇溶解并定容，制备浓度均为0.10mg·mL-1的混合对照品溶液，备用.

（2）瓜蒌提取物供试品溶液的制备.取不同批次瓜蒌提取物，精密称定，以15%甲醇溶解并定容，制备浓度为0.5g/mL的瓜蒌提取物溶液，备用.

2.2 色谱条件

色谱柱为YMC-PackODS-A（250mm×4.6mm，5μm）；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～25min，100%B；25～40min，98%B；40～90min，98%B→80%B；90～200min，80%B→80%B.柱温为25℃，检测器为DAD，检测波长为254nm，流速为1.0mL·min-1，进样量为10μL.

3 结果

3.1 瓜蒌提取物HPLC化学指纹特征

（1）10批瓜蒌提取物的指纹图谱.瓜蒌提取物及对照品的色谱图，见图1.根据《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，设置1号样品色谱图为参照图谱，经多点校正，Mark峰匹配，生成对照图谱，得到共有峰的数目为44个.其中1、2、3、4、5号峰分别为尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷、鸟苷.

图1 瓜蒌提取物（a）及对照品（b）HPLC色谱图

图2 10批瓜蒌提取物HPLC指纹图谱

表1 10批瓜蒌提取物的相似度值（±s，n=10）

表1 10批瓜蒌提取物的相似度值（±s，n=10）

（2）指纹图谱相似度的计算.计算10批瓜蒌提取物的指纹图谱与共有模式的相似度.结果见图2，表1.

3.2 瓜蒌提取物中5种成分的定量分析

（1）标准曲线的建立.精密吸取混合对照品溶液，稀释2、4、8、16倍，按“2.2”项下色谱条件进样.以对照品溶液的质量浓度 x（μg·mL-1）为横坐标，峰面积y为纵坐标进行线性回归.结果见表2.

表2 5种成分的回归方程

（2）方法学考察.

①精密度.取瓜蒌提取物（批号：lwy170601）适量，按“2.1（2）”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件，连续进样5次.结果显示，尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷、鸟苷峰面积的RSD分别为0.1%、0.3%、0.3%、0.2%、0.3%，表明仪器精密度良好.

②稳定性.取瓜蒌提取物（批号：lwy170601）适量，按“2.1（2）”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件，分别在0h、6h、12h、18h、24h进行测定.结果显示，尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷、鸟苷峰面积的RSD分别为1.7%、2.5%、0.9%、1.5%、2.7%，表明样品溶液在24h内稳定性良好.

③重复性.取瓜蒌提取物5份（批号：lwy170601～lwy170605），按“2.1（2）”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件测定.结果显示，尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷、鸟苷峰面积的RSD分别为3.2%、2.4%、3.9%、1.4%、3.2%，表明方法重复性良好.

④加样回收率.取已知尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷、鸟苷含量的瓜蒌提取物（批号：lwy170601）供试品溶液9份，分为3组，每组3份，每组分别按尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷、鸟苷已知含量的80%、100%、120%精密加入对照品.按“2.2”项下色谱条件进样测定.结果见表3、表4.

表3 加样回收率试验结果

表4 瓜蒌提取物中5种成分的定量分析结果（±s，n=10）

表4 瓜蒌提取物中5种成分的定量分析结果（±s，n=10）

尿嘧啶次黄嘌呤黄嘌呤腺苷鸟苷1.12±0.13 0.45±0.05 0.15±0.04 1.53±0.06 1.16±0.18

4 讨论

本研究考察了SynergiTMHydro-RP（4.6mm×250mm，4μm）和 YMC-Pack ODS-A（250mm ×4.6mm，5μm.）色谱柱及甲醇（乙腈）-水、甲醇（乙腈）-0.1%磷酸水溶液及甲醇（乙腈）-0.1%磷酸-0.02%三乙胺水溶液等流动相对瓜蒌提取物中主要色谱峰分离效果的影响，结果以YMC-Pack ODS-A（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱及甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相，瓜蒌提取物的分离效果可满足分析要求.流动相的pH对瓜蒌提取物中核苷类成分的分离效果影响较大，应注意保持流动相pH值的稳定.

现有文献对瓜蒌的化学成分和药理作用研究较多，但尚未有较为统一的瓜蒌提取物制备方法及质量评价方法.本课题组制备的瓜蒌提取物为瓜蒌经水提醇沉后冷冻干燥制备而得.药理学研究表明［7-8］，瓜蒌提取物保留了瓜蒌的药效成分，具有较好的抗氧化活性和抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用，可用于制备瓜蒌滴丸、瓜蒌片等现代剂型.中药指纹图谱用于中药的质量评价已被国内外广泛认可.由实验结果可知，10批瓜蒌提取物HPLC化学指纹特征相似度的平均值为0.98，s值为0.005，说明不同批次的瓜蒌提取物的化学指纹特征相似度较高，且精密度较好，瓜蒌提取物的质量较为稳定.可设定瓜蒌提取物的化学指纹特征相似度值不得低于0.95.

课题组前期研究结果表明，腺苷、鸟苷、尿嘧啶、次黄嘌呤等和瓜蒌抗凝血作用有着重要联系［7］，为此，本实验在建立瓜蒌提取物HPLC指纹图谱的同时，对尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷、鸟苷等5种成分进行了定量分析，方法准确，可靠，可满足瓜蒌提取物的质量控制要求.结合本实验瓜蒌提取物的化学指纹特征及尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷、鸟苷等5种成分的定量分析，可进一步进行瓜蒌提取物药效学及谱效关系研究.