鸟苷酸发酵工艺优化

刘晨，丁长河＊，金少举，陈复生，杜娟

（1.河南工业大学 食品学院，郑州 450001；2.河南省南街村（集团）有限公司，河南 漯河 462000）

鸟苷酸作为组成核酸的5种核苷酸之一，具有独特的香菇样鲜味，因其鲜味阈值达到0.0125g/dL，常被用于增强食品的鲜味［1］。在食品工业中主要以其钠盐（鸟苷酸二钠）的形式作为食品添加剂，用作调味料、酱油、味精的原料，通常与谷氨酸盐一起用于增强食品的鲜味［2］。在医药领域，鸟苷酸具有高度的生物活性，可以提高机体免疫力、辅助抗肿瘤、促进生长以及调节机体营养代谢，能够促进肝功能恢复、调节机体免疫功能、抗癌等［3－6］，使鸟苷酸成为极具开发潜质的医药原料。此外，鸟苷酸具有的抗氧化活性，对神经的生长影响非常大［7－10］，可以保护细胞免受活性自由基的侵害。鸟苷酸在食品以及药品工业中都起着不可估量的作用。

鸟苷酸的生产方法有酶水解RNA法、菌体自溶法、发酵法和化学合成法4种方法。鸟苷酸生产工艺目前运用最广泛的是发酵转化法，利用一定微生物，以葡萄糖作为碳源生产鸟苷，再利用生物或化学方法将其转化为鸟苷酸，如鸟苷磷酸化得鸟苷酸，且工业化生产鸟苷酸的方法就是采用鸟苷发酵的二步生产法［11，12］。

目前，我国鸟苷酸发酵得率较国外先进水平低，鸟苷酸工业化生产还未成熟，如何提高鸟苷酸产量成为研究的重中之重。本文研究发酵培养基配方及发酵条件对鸟苷产量的影响，通过单因素试验及正交试验对发酵培养基的组成及发酵条件进行优化［13，14］，得到最佳发酵工艺，提高鸟苷酸发酵得率。

1 试验材料

1.1 菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）变异菌株：由河南省南街村（集团）有限公司提供。

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基（%）

蛋白胨1.0；氯化钠0.5；牛肉膏粉0.3；琼脂1.5。

1.2.2 种子培养基（%）

蛋白胨1.0；牛肉膏0.3；氯化钠0.5。

1.2.3 发酵培养基（%）

葡萄糖12.0；酵母粉1.6；玉米浆0.2；谷氨酸钠1.0；磷酸氢二钾0.2；氯化钙0.2；碳酸钙2.0；硫酸铵2.0；硫酸镁0.05。

1.3 主要试剂

葡萄糖（AR）、硫酸镁（AR）、碳酸钙（AR）、氯化钙（AR）、磷酸氢二钾（AR）、硫酸铵（AR）、氢氧化钠（AR）、氯化钠（AR）、乙腈（HPLC）：天津市科密欧化学试剂有限公司；谷氨酸钠（BR）：Solarbio公司；酵母浸粉（BR）、牛肉膏（BR）、蛋白胨（BR）、营养琼脂（BR）：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.4 主要仪器

高效 液 相 色 谱 仪 （Agilent Technologies 1260 Infinity） 安捷伦科技公司；电热恒温培养箱（DNP－9052） 上海精宏实验设备有限公司；手提式压力蒸汽灭菌器（DSX－280B） 上海申安医疗器械厂；单人单面净化工作台（SW－CJ－1FD） 苏州净化设备有限公司；台式低速离心机（TDL－5A） 金坛市医疗仪器厂；漩涡振荡器（UVS－1） 北京优晟联合科技有限公司；电子万用炉（DL－1） 北京市永光明医疗仪器有限公司；数显气浴恒温振荡器（SHZ－2A） 金坛华峰仪器有限公司；电子天平（JY5002） 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅（DK－98－Ⅱ） 天津市泰斯特仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 菌种活化

菌种定期活化，取斜面保藏菌种划线接种于活化斜面，置于恒温培养箱中36℃恒温静置培养24h。

2.2 摇瓶种子培养

在500mL三角瓶中加入50mL种子培养基，8层纱布封口，置于高压灭菌锅中在121℃下灭菌15min，在恒温水浴锅中恒温至36℃，接种1环或2环斜面保存菌种，36℃，100r/min，在恒温振荡培养箱中培养12～15h。

2.3 发酵培养

在500mL三角瓶中加入27mL种子培养基，8层纱布封口，置于高压灭菌锅中在121℃下灭菌15min，在恒温水浴锅中恒温至36℃，接种种子液3mL，36℃，110r/min，在恒温振荡培养箱中培养72h。

2.4 正交试验设计

将发酵培养基中葡萄糖、酵母粉、玉米浆、谷氨酸钠等成分及发酵条件如温度、发酵时间、pH等进行单因素试验，再选取对鸟苷产量有显著性影响的单因素，考虑因素间交互作用进行三因素三水平正交试验。

2.5 发酵样品预处理

准确吸取发酵样品0.1mL于10mL离心管中，用4mol/L NaOH 定容至10mL，混合均匀，沸水浴5min，再以3000r/min离心5min。取离心后上清液1mL，稀释定容至100mL，供测定。采用高效液相色谱法测定发酵液中的鸟苷含量，柱子：C18，流动相：乙腈∶水为10∶90，流速：1mL/min，检测波长：256nm，柱温：25℃，进样量：10μL［15］。

3 结果和讨论

3.1 发酵培养基对鸟苷产量的影响

3.1.1 葡萄糖浓度对鸟苷产量的影响

选取葡萄糖浓度8%，10%，12%，14%，16%5个水平，在发酵条件为菌种培养时间12h、接种量10%、发酵时间72h、发酵液pH 7.0、发酵温度36℃时，葡萄糖浓度与鸟苷产量关系见图1。

图1 葡萄糖浓度与鸟苷产量关系Fig.1The relationship between the concentration of glucose and the yield of vernine

由图1可知，当葡萄糖浓度为12%时，鸟苷产量最高，达到7.6g/L。显著性分析表明：葡萄糖浓度为12%时鸟苷产量与8%，14%，16%3组之间存在极显著性差异（P＜0.01），与葡萄糖浓度10%组之间存在显著性差异（P＜0.05），葡萄糖浓度对鸟苷产量有显著性影响。

3.1.2 酵母粉浓度对鸟苷产量的影响

发酵条件同3.1.1，葡萄糖浓度为12%，选取酵母粉浓度为1.2%，1.6%，2.0%，2.4%，2.8%5个水平进行鸟苷发酵，酵母粉浓度与鸟苷产量关系见图2。

图2 酵母粉浓度与鸟苷产量关系Fig.2The relationship between the concentration of yeast powder and the yield of vernine

由图2可知，在酵母粉浓度为1.6%时，鸟苷产量最高，达到6.5g/L。显著性分析表明：酵母粉浓度为1.6% 时鸟苷产量与1.2%，2.0%，2.4%，2.8%4组之间均存在极显著性差异（P＜0.01），鸟苷产量呈现先上升后下降的趋势；酵母粉浓度达1.6%之后，随着酵母粉含量增加，反而对鸟苷发酵有抑制作用。

3.1.3 玉米浆粉浓度对鸟苷产量的影响

发酵条件同3.1.1，葡萄糖浓度为12%，酵母粉浓度为1.6%，选取玉米浆粉浓度0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%5个水平，玉米浆粉浓度与鸟苷产量关系见图3。

图3 玉米浆粉浓度与鸟苷产量关系Fig.3The relationship between the concentration of corn starch and the yield of vernine

由图3可知，玉米浆粉浓度为0.2%时，鸟苷产量最高，产量达到6.2g/L。显著性分析表明：玉米浆粉浓度为0.2% 时，鸟苷产量与0.1%，0.15%，0.25%，0.3%4组之间均存在极显著性差异（P＜0.01），鸟苷产量呈现先上升后下降趋势；玉米浆粉浓度达1.6%之后，随着浓度增加，反而不利于鸟苷产量积累。

3.1.4 谷氨酸钠浓度对鸟苷产量的影响

发酵条件同3.1.1，葡萄糖浓度为12%，酵母粉浓度为1.6%，玉米浆粉浓度为0.2%，选取谷氨酸钠浓度0.8%，1.0%，1.2%，1.4%，1.6%5个水平，谷氨酸钠浓度与鸟苷产量关系见图4。

图4 谷氨酸钠与鸟苷产量关系Fig.4The relationship between the concentration of sodium glutamate and the yield of vernine

由图4可知，当谷氨酸钠浓度为1%时，鸟苷产量达到7.3g/L。显著性分析表明：谷氨酸钠浓度为1%时鸟苷产量与0.8%，1.2%，1.4%，1.6%4组之间均存在极显著性差异（P＜0.01），谷氨酸钠浓度对鸟苷发酵有显著影响。

3.1.5 硫酸铵浓度对鸟苷产量的影响

发酵条件同3.1.1，葡萄糖浓度为12%，酵母粉浓度为1.6%，玉米浆粉浓度为0.2%，谷氨酸钠浓度为1.0%，选取硫酸铵浓度为1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%5个水平，硫酸铵浓度与鸟苷产量关系见图5。

图5 硫酸铵浓度与鸟苷产量关系Fig.5The relationship between the concentration of ammonium sulfate and the yield of vernine

由图5可知，当硫酸铵浓度为2.0%时，鸟苷产量达到6.2g/L，随着硫酸铵浓度增加，鸟苷产量呈现先升高后下降的趋势。显著性分析表明：硫酸铵浓度为2.0% 时鸟苷产量与1.0%，1.5%，3.0%3组之间均存在极显著性差异（P＜0.01），与2.5%组之间存在显著性差异（P＜0.05）。

3.2 不同发酵条件对鸟苷产量的影响

3.2.1 接种时间对鸟苷产量的影响

鸟苷产量不仅与发酵培养基配方有关，还与种子生理性状有很大关系。菌种培养时间不足，转入发酵培养基中，会出现种子前期生长缓慢，整个发酵周期延长，产物开始形成的时间推迟等常见的几种现象，甚至会出现发酵异常现象。菌种培养时间过长，菌体会在种子培养基中过早自溶，会影响后期鸟苷积累。选取培养8，10，12，14，16h的种子菌种转入发酵培养基，接种时间与鸟苷产量关系见图6。

图6 不同接种时间与鸟苷产量关系Fig.6The relationship between the inoculation time and the yield of vernine

由图6可知，培养12h的种子液转移至发酵培养基得到鸟苷产量最高，达6.9g/L。显著性分析表明：接种时间为12h时鸟苷产量与8，10，14，16h4组不同接种时间之间均存在极显著性差异（P＜0.01），确定最适接种时间为12h。

3.2.2 接种量对鸟苷产量的影响

培养基中营养成分有限，接种量多少对鸟苷积累有显著影响。接种量少，培养基得不到充分利用；接种量过多，培养基营养有限，会对鸟苷积累产生抑制作用。

图7 接种量与鸟苷产量关系Fig.7The relationship between the inoculum size and the yield of vernine

选取接种量为6%，8%，10%，12%，14%5个水平，随着接种量增加，鸟苷产量呈现先升高后下降的趋势。由图7可知，当接种量为10%时，鸟苷产量达到6.4g/L。显著性分析表明：接种量为10%时鸟苷产量与6%，8%，14%3组不同接种量之间均存在极显著性差异（P＜0.01），与12%接种量之间存在显著性差异（P＜0.05），确定最适接种时间为12h。

3.2.3 发酵时间对鸟苷产量的影响

选取发酵时间48，54，60，66，72，78h6个水平，发酵时间与鸟苷产量关系见图8。

图8 发酵时间与鸟苷产量关系Fig.8The relationship between the fermentation time and the yield of vernine

由图8可知，当发酵时间为72h时，鸟苷产量达到7.9g/L。显著性分析表明：发酵时间为72h时鸟苷产量与48，54，60，66，78h5组不同发酵时间之间均存在极显著性差异（P＜0.01），发酵时间对鸟苷产量有显著性影响。

3.2.4 发酵pH对鸟苷产量的影响

发酵培养基pH是微生物发酵的一项重要的发酵参数，是微生物在发酵液中代谢活动的综合指标。pH通过影响微生物内酶活力，从而影响微生物生长和产物积累。

图9 发酵pH与鸟苷产量关系Fig.9The relationship between the pH and the yield of vernine

选取pH 值为6.6，6.8，7.0，7.2，7.4 5个水平进行发酵，由图9可知，当pH值为7.0时，鸟苷产量最高，达到6.8g/L。显著性分析表明：发酵pH为7.0时鸟苷产量与6.6，7.4 2组之间均存在极显著性差异（P＜0.01），与pH 为6.8组存在显著性差异（P＜0.05），与pH 为7.2组不存在差异性（P＞0.05），pH 在7.0～7.2范围内，鸟苷产量较高。

4.文章字数控制在1500字或3000字左右，末尾附上作者姓名、单位、联系方式、自我介绍（100字内）。

3.2.5 发酵温度对鸟苷产量的影响

温度对微生物发酵有很大影响。温度通过影响微生物各种酶反应速率，改变微生物代谢调控机制，从而影响发酵培养基的理化性质，最终影响发酵产物的积累。

图10 发酵温度与鸟苷产量关系Fig.10The relationship between the fermentation temperature and the yield of vernine

试验选取32，34，36，38，40℃5个水平，由图10可知，最佳发酵温度为36℃，此温度下，鸟苷产量最高，达到8.0g/L。显著性分析表明：发酵温度为36℃时鸟苷产量与32，34，38，40℃4组不同发酵温度之间均存在极显著性差异（P＜0.01），发酵温度对鸟苷产量有显著性影响。

3.3 正交试验

正交试验设计和分析方法是目前最常用的工艺优化试验设计和分析方法。鸟苷酸发酵培养基成分复杂，交互作用错综复杂，发酵条件对鸟苷产量影响显著，因此，鸟苷酸发酵培养基和发酵条件优化工作尤为重要。

3.3.1 正交试验结果

表1 正交试验设计表Table 1Orthogonal test design table

为研究因素间的交互作用，采用L27（311）正交试验表，见表2。

表2 正交试验结果Table 2The results of orthogonal test

3.3.2 正交试验结果分析

直观分析见表3。

表3 鸟苷产量均值响应表Table 3The mean response of the yield of vernine

由表3可知，以鸟苷产量为评价指标，可知发酵温度对鸟苷产量影响最大，各因素对鸟苷产量的影响依次为发酵温度（B）＞发酵时间（C）＞葡萄糖浓度（A）。以鸟苷产量为分析指标，选择鸟苷产量高的组合，通过直观分析可知最佳组合为A1B2C2。

方差分析结果见表4。

表4 鸟苷产量方差分析表Table 4Analysis of variance of the yield of vernine

由表4可知，发酵温度与发酵时间对鸟苷产量影响达到了极显著性差异（P＜0.05），葡萄糖浓度对鸟苷产量影响不显著，交互作用对结果均不显著。由此分析，结合直观分析结果，以鸟苷产量为指标，最佳组合为A1B2C2，即葡萄糖浓度10%，发酵温度36℃，发酵时间72h。再次在发酵条件下进行验证性试验，得到鸟苷产量达到10.6g/L。

4 结论

单因素试验确定了发酵培养基配方中葡萄糖、酵母粉、玉米浆粉、谷氨酸钠及硫酸铵的最佳浓度，确定了发酵工艺参数适宜范围，通过正交试验对鸟苷产量有显著性影响的葡萄糖浓度、发酵时间、发酵温度3个发酵工艺条件进行优化，确定最优组合为葡萄糖浓度10%，发酵温度36℃，发酵时间72h。在此条件下进行鸟苷发酵试验，鸟苷产量达到10.6g/L，产量较优化前提高了71%。