枯草芽孢杆菌产腺苷补料发酵工艺的研究

◎ 陈华强

（广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，广东 肇庆 526040)

腺苷（Adenosine）是一种核苷类物质，存在于不同类型的细胞中，是冬虫夏草、灵芝及人参等名贵药材的主要活性成分，在人体的核苷代谢和生理生化方面起着重要作用，在食品、保健品、医药和化工等领域有着广泛的应用[1-2]。国内对腺苷的研究主要集中于菌株诱变筛选、发酵动力学研究、培养基优化等[3-5]。梅漫莉等[6]研究了黄嘌呤和谷氨酰胺对产腺苷的影响，通过底物添加、流加补料的发酵方式加入黄嘌呤、谷氨酰胺，有效地提高了腺苷的产量。根据核苷酸代谢的补救途径，腺苷合成的前体物质为次黄嘌呤，因此在发酵过程中添加适量的前体物质次黄嘌呤可以增加腺苷的产率[7]。陈华强[8]研究了柠檬酸钠与HMP代谢途径中碳流量的关系以及次黄嘌呤对发酵产苷和发酵过程的影响，结果发现次黄嘌呤可以使腺苷发酵产量增加。本研究拟考察发酵液中次黄嘌呤前体物质的质量浓度与发酵产率的关系、次黄嘌呤前体物质加入方式与腺苷产量的关系，通过摇瓶、50 L发酵罐、10 m³发酵中试罐，整合补料与溶解氧的发酵过程调控，逐级放大试验，以期为工业化应用研究开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 发酵菌种

发酵菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，组氨酸和黄嘌呤缺陷）AR090，由广东肇庆星湖生物科技股份有限公司分离和保藏。

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基

酵母膏 5.0 g·L-1，牛肉膏 10 g·L-1，氯化钠 2.5 g·L-1，琼脂 25 g·L-1，蛋白胨 4.0 g·L-1，pH 值为 7.0 ～ 7.2，灭菌压力0.1 MPa，灭菌时间20 min[8]。

1.2.2 种子培养基

酵母膏 20 g·L-1，葡萄糖 20 g·L-1，硫酸铵 5 g·L-1，七水硫酸亚铁0.01 g·L-1，磷酸二氢钾3 g·L-1，七水硫酸镁 0.3 g·L-1，七水硫酸锰 0.01 g·L-1，黄嘌呤 0.03 g·L-1，组氨酸0.03 g·L-1，pH值为7.0～7.2，灭菌压力0.1 MPa，灭菌时间20 min[8]。

1.2.3 摇瓶培养基

酵母浸粉 30 g·L-1，葡萄糖 80 g·L-1，玉米浆膏100 g·L-1， 七 水 硫 酸 镁 0.6 g·L-1， 硫 酸 铵 15 g·L-1，磷 酸 二 氢 钾 1.2 g·L-1， 黄 嘌 呤 0.05 g·L-1， 组 氨 酸0.03 g·L-1，pH值为7.0～7.2，灭菌压力0.1 MPa，灭菌时间20 min[8]。

1.2.4 发酵培养基

酵母浸粉 50 g·L-1，葡萄糖 100 g·L-1，玉米浆膏120 g·L-1，七水硫酸镁 0.6 g·L-1，硫酸铵 5 g·L-1，磷酸二氢钾 1.2 g·L-1，柠檬酸钠 2 g·L-1，黄嘌呤 0.05 g·L-1，组氨酸0.03 g·L-1，pH值为7.0～7.2，灭菌压力0.1 MPa，灭菌时间20 min[8]。

1.3 仪器与设备

全自动发酵系统：WMC-9050L/A/S，上海万木春生物工程有限公司，配备pH电极和DO电极；10 m3发酵罐：配有1 m³种子罐和5 m3补糖罐各一个；分光光度计：722N，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；高效液相色谱系统：UltiMate 3000 HPLC，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；生物传感分析仪：SBA-40E，山东省科学院生物研究所。

1.4 试验方法

1.4.1 摇瓶发酵试验

（1）菌种培养。取甘油菌种，接种于斜面培养基，在32 ℃条件下恒温培养12 h，作为活化种子。

（2）摇瓶种子培养。接一环长势良好的斜面菌种至20 mL种子培养基中，于500 mL三角瓶培养，采用旋转式摇床，频率180 r·min-1，温度34 ℃，摇床培养12 h。

（3）摇瓶发酵培养。将种子液按10%接种量接至20 mL发酵培养基中，于500 mL三角瓶培养，采用旋转式摇床，频率200 r·min-1，温度36 ℃，摇床培养48 h。

1.4.2 自控发酵罐试验

50 L自控发酵罐，接入发酵液10%比例的摇瓶培养种子液。发酵液装量为30 L，灭菌温度121 ℃，灭菌时间30 min，发酵温度36 ℃，控制pH值=7.0，通气搅拌培养。根据摇瓶发酵试验结果，在50 L自控罐进行发酵试验，初始装量30 L，底糖浓度为10%，补糖10 L，浓度为50%。考察次黄嘌呤添加方式、发酵分阶段溶解氧控制与腺苷产量的关系。

（1）考察次黄嘌呤添加时机及方式与腺苷发酵的关系的试验设计。实验设计加入底料、一次性加入、分批次加入和流加补料4种添加方式。①加入底料的方式。在发酵培养基中加入6 g·L-1的次黄嘌呤。②一次性加入的方式。在发酵18 h后一次性加入3 g·L-1的次黄嘌呤。③分批次加入的方式。分别在18 h、30 h加入3 g·L-1的次黄嘌呤。④流加补料的方式。在补糖液中加入次黄嘌呤质量浓度为9 g·L-1，发酵18 h后持续流加。发酵过程中每隔6 h测定菌体浓度（OD600）和腺苷产量。

（2）分阶段溶氧控制连续流加次黄嘌呤工艺对腺苷发酵的影响的试验设计。实验设计分阶段溶氧控制连续流加、固定式溶氧控制连续流加、分阶段溶氧控制未添加3种控制工艺。①分阶段溶氧控制连续流加工艺。根据菌体的生长情况，分阶段控制溶氧条件，在发酵前期（18 h前），控制溶解氧浓度在20%，在发酵中后期流加补料次黄嘌呤后，控制溶解氧浓度在10%～20%。②固定式溶氧控制连续流加工艺。在发酵全部过程中，控制溶解氧浓度在20%，在发酵中后期流加补料次黄嘌呤。③分阶段溶氧控制未添加工艺。溶氧控制与分阶段溶氧控制连续流加工艺相同，不同点为未添加次黄嘌呤。发酵过程中每隔6 h测定菌体浓度（OD600）、葡萄糖质量浓度和腺苷产量。

1.4.3 10 m3发酵罐试验

发酵罐材质304，pH值、温度自控，变频器调节转速，体积10 m3，装液体积6 m3，中控电脑显示pH值、溶氧、温度和转速等参数，pH与液氨系统连锁，自动调节控制。种子罐材质304，pH值、温度自控，变频器调节转速，体积1 m3，装液体积0.6 m3，中控电脑显示pH值、溶氧、温度和转速等参数，pH与液氨系统连锁，自动调节控制。

1.5 分析方法

（1）菌体浓度的测定。发酵液经稀释后，采用分光光度计检测600 nm波长的OD值，计算菌体浓度。公式为：

式中：X1为菌体浓度（OD600值）；v1为样品体积，mL；V1为稀释后样品体积，mL；A为稀释后样品OD值。

（2）葡萄糖质量浓度的测定。利用生物传感分析仪，进行发酵上清液的检测，计算葡萄糖质量浓度。公式为：

式中：X2为葡萄糖质量浓度，g·L-1；v2为样品体积，mL；V2为稀释后样品体积，mL；c2为稀释后样品测定值，mg·dL-1。

（3）腺苷产量的测定。参考文献[9]方法进行检测，计算腺苷产量。公式为：

式中：X3为腺苷产量，g·L-1；v3为样品体积，mL；V3为稀释后样品体积，mL；c3为稀释后样品测定值，mg·L-1。

2 结果与分析

2.1 次黄嘌呤质量浓度对腺苷发酵的影响

徐海等[7]研究了次黄嘌呤对肌苷合成代谢的影响，发现发酵液中的次黄嘌呤参与核苷代谢过程，添加次黄嘌呤利于半合成途径肌苷的生成，在腺苷生物合成途径中，次黄嘌呤是腺苷的合成前体。根据核苷酸补救途径理论，发酵过程中添加前体，可以促进腺苷的合成，提高发酵水平。试验设计在腺苷摇瓶发酵18 h和30 h后，分别添加次黄嘌呤，考察次黄嘌呤质量浓度对腺苷发酵的影响。

由图1可知，次黄嘌呤的添加对腺苷的生物合成有促进作用，随着次黄嘌呤添加量的增加，腺苷产量逐渐增加，当达到合适浓度后，再增加次黄嘌呤的浓度，腺苷发酵水平的增长幅度减小。因此选择合适的浓度可以提高产量，即添加次黄嘌呤质量浓度为3 g·L-1时，腺苷产量最高，可达15.1 g·L-1，比不添加次黄嘌呤的腺苷产量提高了29.06%。

图1 次黄嘌呤质量浓度对腺苷发酵的影响图

2.2 50 L发酵罐添加次黄嘌呤的腺苷发酵试验

2.2.1 次黄嘌呤添加时机及方式与腺苷发酵的关系

次黄嘌呤参与腺苷的合成代谢，培养基中次黄嘌呤的质量浓度对腺苷发酵有重要的影响[8]。在发酵的不同阶段，采用不同的方式添加次黄嘌呤，可以考察添加时机及添加方式对发酵的影响。

由图2可知，培养基中加入次黄嘌呤，发酵前期，菌体快速生长，发酵0～24 h，4种添加方式的OD600值基本无差异，腺苷产量也基本一致。随着发酵进行，发酵30 h后，流加补料和分批添加的方式OD600值要优于一次加入和底料添加的方式，这可能是因为菌体利用前体物质的转化效率存在差异，流加补料或者分批补入次黄嘌呤的方式更有利于菌体生长，有利于产物的生成。腺苷的最终产量分别为28.4 g·L-1、29.5 g·L-1、31.0 g·L-1和 32.1 g·L-1，结果表明流加补料次黄嘌呤，利于发酵菌体生长和腺苷合成，腺苷产量高，可以达到 32.1 g·L-1。

图2 次黄嘌呤添加时机及方式与腺苷发酵的关系图

2.2.2 分阶段溶氧控制连续流加次黄嘌呤工艺对腺苷发酵的影响

刘剑等[10]研究了溶解氧水平与发酵腺苷的关系，发现分阶段调节利于发酵培养腺苷生成，本文在此基础也研究了分阶段溶氧控制连续流加次黄嘌呤工艺对腺苷发酵的影响。由图3可知，在发酵中后期，分阶段溶氧控制连续流加次黄嘌呤工艺腺苷产量，明显高于固定式溶氧控制连续流加次黄嘌呤工艺和分阶段溶氧控制未添加次黄嘌呤工艺，分阶段溶氧控制连续流加次黄嘌呤工艺最终腺苷产量为34.5 g·L-1，对比固定式溶氧控制连续流加次黄嘌呤工艺腺苷产量32.1 g·L-1提高了7.48%，对比分阶段溶氧控制未添加次黄嘌呤工艺腺苷产量22.8 g·L-1提高了51.32%，分阶段溶氧控制连续流加次黄嘌呤工艺腺苷产量有明显的优势。

图3 分阶段溶氧控制连续流加次黄嘌呤工艺对腺苷发酵的影响图

2.3 10 m3发酵罐添加次黄嘌呤的腺苷发酵试验

在10 m3发酵罐进行腺苷流加补料工艺放大试验，补糖液中加入，次黄嘌呤质量浓度为9 g·L-1，根据发酵过程分阶段控制溶氧条件，取得稳定的发酵结果。如表1所示，50 h左右发酵周期腺苷产量平均达35.06 g·L-1，工艺有较好的工业化价值。

表1 10 m3发酵罐添加次黄嘌呤的腺苷发酵试验表

3 结论

本文研究了腺苷发酵添加前体物质次黄嘌呤对发酵水平的影响，研究了次黄嘌呤前体物质的质量浓度与发酵产率的关系以及次黄嘌呤前体物质加入方式与腺苷产量的关系，通过分阶段控制溶氧条件，在摇瓶、50 L发酵罐、10 m³发酵中试罐进行逐步试验和放大，整合培养基优化和溶解氧调节，提高了腺苷产量。研究结果表明在发酵过程的18 h和30 h分两次补充3 g·L-1次黄嘌呤，可使腺苷产量大幅度提升；固定式溶氧控制连续流加次黄嘌呤的方式腺苷产量达到32.1 g·L-1；分阶段溶氧控制连续流加次黄嘌呤工艺腺苷产量达到34.5 g·L-1；在10 m3中试发酵罐进行补料流加工艺放大，流加补糖含9 g·L-1的次黄嘌呤，并通过阶段控制溶氧条件，产量达到35.06 g·L-1，工艺有较好的工业化价值。