KU004抑制人源乳腺癌BT474裸鼠异种移植模型肿瘤生长的作用

孙兰 李家春 李瑛光 郭庆明王振中

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，死亡率较高，居全球恶性肿瘤死亡率第5位［1］。临床上约30%的乳腺癌患者HER2呈阳性，这部分患者易复发、转移，且预后较差［2-4］。研究表明HER2阳性型乳腺癌患者对三苯氧胺和细胞毒性化疗药物耐药［5］，但蒽环类和紫杉类药物疗效较好。拉帕替尼是一种新型小分子酪氨酸激酶抑制剂，对内皮细胞生长因子和HER2均有抑制作用［6-7］，常用于治疗HER2阳性型乳腺癌患者［8］，但是针对HER家族的靶向酪氨酸激酶抑制剂易耐药、单药治疗有效率低、价格昂贵，尤其是耐药性，已成为乳腺癌分子靶向治疗面临的难题。KU004是在抗癌药物拉帕替尼的结构上进行改造的新化合物，本研究以人源乳腺癌BT474细胞为受试细胞，建立体内裸鼠皮下移植瘤模型，评价KU004抑制移植瘤的效果，以期为乳腺癌的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

BALB/c 裸鼠 60 只，雌性，体重 18～22 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物质量合格证号：0278539，许可证号：SCXK（京）2014-0004。动物实验过程均符合动物伦理委员会相关法规。人源乳腺癌BT474细胞购自美国菌种保藏中心。KU004购自江苏康缘药业股份有限公司，羟丙基甲基纤维素购自天津爱勒易医药材料有限公司，胎牛血清购自上海玉博生物科技有限公司。

1.2 人源乳腺癌BT474裸鼠异种移植模型的建立

人源乳腺癌BT474细胞用含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/mL链霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养。正常传代培养，每周传代2次，将处于对数生长期的肿瘤细胞接种于裸鼠体内。肿瘤细胞接种前1 d，每只裸鼠左侧肩胛部皮下植入雌激素片（17-estradiol），于次日在每只裸鼠右侧前胁肋部皮下接种PBS重悬的人源乳腺癌BT474肿瘤细胞8×107个/mL（加等体积Matrigel基质胶），共接种60只。

1.3 分组及处理

人源乳腺癌BT474细胞接种第17天测量每只裸鼠的肿瘤体积，选取肿瘤体积为100～160 mm3的40只裸鼠，根据肿瘤体积大小随机分为以下5组，每组8只：模型组（0.5%羟丙基甲基纤维素溶液灌胃）、拉帕替尼组（80 mg/kg拉帕替尼灌胃）、KU004低剂量组（40 mg/kg KU004灌胃）、KU004中剂量组（80 mg/kg KU004灌胃）、KU004高剂量组（120 mg/kg KU004灌胃）。各剂量组受试药物均用0.5%羟丙基甲基纤维素溶液按所需浓度配制，从肿瘤细胞接种第20天开始灌胃给药，每天1次，连续给药21 d。

1.4 裸鼠肿瘤生长的测量

使用游标卡尺分别于给药前以及给药后1 d、4 d、7 d、11 d、14 d、17 d、21 d 测量肿瘤的长径和短径并称量体重，于末次给药后24 h脱颈处死裸鼠，剥离肿瘤并称重。计算肿瘤体积（tumor volume，TV）、相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV）、相对肿瘤增殖率（T/C）及肿瘤抑制率（inhibition rate，IR），计算公式如下：TV=0.5×长径×短径2；RTV=TVt/TV0（TV0为分组给药时测量的肿瘤体积，TVt为每次测量的肿瘤体积）；T/C=TRTV/CRTV×100%（TRTV为给药物组 RTV 的均值，CRTV为模型组RTV的均值）；IR=（1-给药物组的平均瘤重/模型组的平均瘤重）×100%。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，肿瘤体积和肿瘤重量组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），若组间差异有统计学意义，进一步的两两比较采用Dunnett T3检验（以模型组为参照组）。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠一般情况

至实验结束，与模型组比较，拉帕替尼组、KU004高剂量组、KU004中剂量组、KU004低剂量组裸鼠饮食、活动、毛色无明显变化，给药期间均无死亡。

2.2 各组裸鼠给药期间体重的变化

拉帕替尼组、KU004高剂量组、KU004中剂量组、KU004低剂量组裸鼠在实验药物剂量下耐受性良好，随给药时间延长各组裸鼠体重变化不大，与模型组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.3 给药期间各组裸鼠TV、RTV的变化

模型组裸鼠随着给药时间延长TV、RTV明显增大，KU004高剂量组、KU004中剂量组裸鼠TV、RTV逐渐减小，各给药组TV、RTV分别与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），拉帕替尼组与KU004中剂量组TV、RTV比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2、表3。给药期间，拉帕替尼组、KU004高剂量组、KU004中剂量组和KU004低剂量组的T/C均有不同程度减小，给药后21 d T/C分别为15.6%、6.9%、11.4%和32.7%，见表4。

表1 给药期间各组裸鼠体重变化（g）

表2 各组裸鼠给药期间的TV（mm3）

表3 各组裸鼠给药期间的RTV

表4 给药期间各组裸鼠的T/C（%）

2.4 给药期间各组裸鼠的肿瘤重量和肿瘤抑制率

末次给药24 h后，脱颈处死裸鼠，拉帕替尼组、KU004高剂量组、KU004中剂量组、KU004低剂量组裸鼠肿瘤的IR分别为85.0%、95.0%、91.0%、67.0%，平均肿瘤重量分别为（0.18±0.02）g、（0.08±0.01）g、（0.04±0.01）g、（0.28±0.04）g，各组的平均肿瘤重量均明显低于模型组的（0.85±0.06）g，差异有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨论

乳腺癌是发生于乳腺上皮组织的恶性肿瘤。有研究报道25%～30%的乳腺癌患者癌细胞HER2受体过表达，此类患者预后明显较HER2低表达患者差［9-10］。HER2已成为乳腺癌分子靶向治疗药物研究的重要靶点［11-12］。目前以HER2为靶点的抗乳腺癌分子靶向治疗药物主要有单克隆抗体（曲妥珠单抗、帕妥珠单抗）、酪氨酸激酶抑制剂（拉帕替尼、吉非替尼）、曲妥珠单克隆抗体-DM1、mTOR抑制剂等［13］。拉帕替尼主要用于治疗HER2阳性的晚期乳腺癌，是继曲妥珠单抗后的第二种乳腺癌分子靶向治疗药物，但其耐药性已成为乳腺癌分子靶向治疗面临的瓶颈，探索新的更高效的抗癌药物成为该领域学者重要的研究课题。

乳腺癌动物模型的建立对人类乳腺癌的预防、诊断、治疗及机制研究有重要作用［14］。裸鼠因先天性缺乏胸腺，T细胞免疫功能接近于零，是进行人乳腺癌细胞异位移植最常用的动物［13］。目前建立的乳腺癌动物模型主要有自发性、诱发性、移植性、基因工程及远处转移模型［15］。移植法是建立乳腺癌动物模型常用的方法，根据移植物来源不同可分为同种移植和异种移植［16］。人源乳腺癌BT474细胞为HER2高表达细胞系，本实验采用该细胞以8×107个/mL接种于裸鼠皮下建立异种移植模型，实验期间均无裸鼠死亡，且成瘤性较好，与文献报道一致［17］。进一步在人乳腺癌裸鼠皮下移植模型中验证KU004的抗癌作用，发现在给药的21 d中各组裸鼠均未出现其他不良反应，拉帕替尼组、KU004高剂量组、KU004中剂量组、KU004低剂量组裸鼠在实验药物剂量下耐受性良好，随给药时间延长各组裸鼠体重变化不大，但T/C均有不同程度减小，各给药组裸鼠肿瘤体积、肿瘤重量与模型组比较均显著减小，肿瘤抑制率分别为85.0%、95.0%、91.0%、67.0%，且在同剂量下KU004的药效略高于拉帕替尼，提示KU004对人源乳腺癌BT474裸鼠异种移植模型肿瘤具有抑制作用，移植瘤增殖速度减慢，在实验药物剂量下裸鼠对KU004耐受较好，后续将继续研究KU004对正常组织及其他乳腺癌细胞异种移植动物模型肿瘤的影响，以进一步验证KU004作用。