重组人源胶原蛋白制备关键技术研究

2020-01-05 08:12张群
食品与生物技术学报 2020年2期
关键词:人源胶原胶原蛋白

重组人源胶原蛋白是基于人胶原蛋白的特征和主要功能序列重新优化设计的基因序列, 表达的蛋白质是设计序列翻译的具有人胶原蛋白特征的蛋白质。 与传统提取获得的胶原蛋白相比,具有可加工性、无病毒隐患、水溶性好、批次稳定和排异反应低等优点。

近年来, 由于其特有的三重螺旋结构和功能特性, 国内外科研人员开始聚焦重组人源胶原蛋白的研究。 Myllyharju 等(2000)使用甲基酵母Pichia pastoris表达人胶原蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。 Rutschmann 等(2014)在大肠杆菌中将人源Ⅲ型胶原蛋白和病毒来源的脯氨酸羟化酶一起共表达,获得羟化的重组胶原蛋白,产量为90 mg /L。 周爱梅等(2015)采用巴氏毕赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9KG6 进行高密度发酵,获得细胞外分泌型重组人源胶原蛋白。 SDS-PAGE 电泳分析证明:RHSC 具有确定的相对分子质量, 分别约为56 000 的蛋白质单体与112 000 的二聚体。实验中运用透析法、盐析与柱层析结合法对工程菌的发酵上清液进行纯化。 侯增淼等(2019)为了获得可实现工业化生产的重组人源性胶原蛋白,根据人Ⅰ型胶原蛋白Gly-X-Y 序列, 优选亲水性的Gly-X-Y 胶原肽段设计人源性胶原蛋白氨基酸序列及对应的核苷酸序列,利用酶切技术构建pPIC9K-COL 表达载体,电转化毕赤酵母获得人源性胶原蛋白毕赤酵母工程菌,并对其进行发酵罐发酵、纯化及鉴定。结果显示,获得表达量达4.5 g/L、纯度大于95%的人源性胶原蛋白。中国专利CN201910420372.2 提供一种重组人源胶原蛋白及其应用, 所述重组人源胶原蛋白从氨基端依次包含:氨基端亲和纯化标签、人源Ⅰ型胶原蛋白α2 链成熟肽链以及羧基端亲和纯化标签。 根据该发明实施例的所述重组人源胶原蛋白,通过在人源Ⅰ型胶原蛋白α2 链成熟肽链的两端都设计有特异性亲和纯化标签,该重组人源胶原蛋白易于分离纯化和检测, 且该重组人源胶原蛋白具有更高的相对分子质量和特殊的理化性质,易于发酵和表达,产量高、用途广。 CN201811590514.1 公开了一种提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白质降解速度的发酵工艺,其首先将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中发酵培养,在甲醇诱导培养阶段向发酵培养基中加入0.1~10 g/L 的柠檬酸铵。 CN201710512319.6 涉及一种酵母重组胶原蛋白的生产方法, 包括重组毕赤酵母工程菌构建及无需甲醇诱导的组成型分泌表达重组胶原蛋白的方法,首先在基因水平上利用毕赤酵母惯用密码子优化胶原基因序列并人工全基因合成,然后整合进酵母染色体中,构建成组成型分泌表达的重组毕赤酵母工程菌。 发酵过程操作简便,产量高。 CN201810707153.8涉及重组人源型胶原蛋白的羟基化方法,通过将来源于孢囊菌RH1 的脯氨酸羟化酶与人源胶原基因共表达,从而实现胶原的羟基化。CN201810062017.8 公开了一种重组人源胶原蛋白的纯化方法,先采用固液分离技术、过滤技术以及超滤技术对大批量的重组人源胶原蛋白进行粗纯,然后用离子交换层析技术进行精纯,所得目标蛋白质纯度大于98%,收率大于70%。CN201810048908.8 公开了一种毕赤酵母表达重组人源胶原蛋白的甲醇流加发酵工艺。所述工艺将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中,培养至甲醇流加诱导阶段,甲醇流加诱导的0~32 h 的前期阶段,甲醇流加速度为(5.25±0.25) L/h,33~96 h 的中期阶段,甲醇流加速度为(6.75±0.25) L/h,97 h 至发酵结束的后期阶段,甲醇流加速度为(5.25±0.25) L/h。该发明将甲醇诱导阶段时改成分阶段恒速流加,可以保证毕赤酵母在不同代谢时期对碳源的需求。CN201410837503.4公开了一种膜过滤法提取重组类人胶原蛋白的方法,采用巴斯德毕赤酵母Pichia pastoriSMD1168 作为菌种,进行种子培养、种子罐培养和发酵罐培养,得到毕赤酵母菌发酵液;通过除杂、脱色、超滤和冻干的操作,从毕赤酵母菌发酵液中提取重组类人胶原蛋白。 CN201310033299.6 公开了一种由真核菌生产的人源化基因重组人胶原蛋白,全长474 个氨基酸,由两段完全相同的人Ⅲ型胶原片段串联而成,C 端连接6 个组氨酸残基作为特异性亲和纯化标记。 基因重组人胶原蛋白性能优于动物胶原蛋白和原核工程菌重组胶原;带有特异性亲和纯化标记,易于得到高纯度产品。

虽然利用重组表达系统生产人源胶原蛋白取得了一些进展, 但是还有很多问题亟需解决, 如表达系统、外源蛋白质表达产量、分离纯化技术等。相信随着基因工程、蛋白质工程技术等分子生物学研究的快速发展,重组人源胶原蛋白在食品、化妆品和生物医学等领域的应用也将得到进一步的提高。

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