荧光免疫层析定量检测髓过氧化物酶方法的建立①

王云龙 马雪虎 李玉林 王继创 潘维成 闫生辉

(郑州大学生命科学学院，郑州450001)

冠心病(Coronary heart disease，CHD)是严重威胁人体健康和生命的常见病，而动脉粥样硬化又是形成冠心病的重要病理基础[1]。髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)是在髓系细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)中合成，并且贮存在嗜苯胺蓝颗粒中的一种血红素辅基蛋白酶[2]。MPO通过产生自由基和多种反应性物质[3]，促进斑块形成和不稳定性增加，加速动脉粥样硬化进展，进而引起多种并发症，如急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome，ACS)[4]。MPO作为一种心血管疾病炎性生物标志物[5]，是该领域的研究热点之一。目前，MPO检测方法有酶联免疫吸附法[6]、免疫比浊法[7]、化学发光法[8]等。虽然这些方法灵敏度与准确度高，但操作过程繁琐，需专业实验室和操作技术人员，难以满足床旁检测的需求[9]。本研究拟建立一种荧光免疫层析MPO检测的新方法，此法有灵敏度高、操作简便、快速等优点[10]，能够满足床旁快检的要求。

1 材料与方法

1.1实验材料、仪器 羧基荧光微球(Bangs)、硝酸纤维素膜(NC膜)、玻璃纤维棉、吸水纸、PVC板、MPO配对抗体、羊抗鼠IgG、牛血清白蛋白(BSA)、MPO线性标准品、MPO精密性质控品均由河南省生物工程技术研究中心提供，碳二亚胺(EDC)，其他化学试剂均为分析纯试剂。本研究临床样本由郑州大学第一附属医院提供。

荧光免疫层析读数仪(杭州峰航科技有限公司)、XYZ三维平面点膜喷金仪(上海金标生物科技有限公司)、台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、101型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1试纸条的制备 参照文献[9]试纸条制备方法。(1)MPO抗体-荧光微球的制备：荧光微球通过EDC活化，与MPO抗体偶联形成复合物，复合物再通过保护液复溶、封闭液封闭等过程，最终制备成MPO抗体-荧光微球以备用。(2)包被与组条：揭去中间粘性贴纸，将NC膜贴入PVC板中部，将稀释成1.5 mg/ml羊抗鼠IgG、2 mg/ml MPO包被抗体分别作为质控线(C线)和检测线(T线)，使用XYZ三维平面点膜喷金仪在NC膜均匀划线(1 μl/cm)，37℃烘干2 h以备用。揭去上、下端两条粘性贴纸，将吸水垫、已铺MPO抗体-荧光微球的结合垫、样品垫依次搭接组装。将组装好的PVC板放入物料放置平台，并切割成宽3.9 mm试纸条，放入铝箔袋(含干燥剂)中密封4℃保存。

1.2.2检测 在试纸条样品垫中间位置滴加70 μl样品，5 min后将试纸条放置在荧光免疫层析读数仪检测，然后在紫外分析仪下观察。

1.2.3工艺条件优化 (1)EDC量的确定：取15 μl 荧光微球加入0.6 ml 0.05 mol/L pH8.0硼酸盐缓冲液中，旋涡震荡混匀；依次加入4 mg/ml EDC各10、20、40、60、80 μl，室温震荡活化30 min，按1.2.1方法制备5种条件试纸条，用线性标准品分别加样检测。(2)标记蛋白量与标记时间的确定在活化后的微球溶液中，依次加入75、100、125、150 μg MPO标记抗体，按30、60、90、120 min时间分别偶联。按1.2.1方法制备不同标记蛋白量和标记时间试纸条，用100 ng/ml的质控品对不同条件试纸条重复检测3条，结果取3次平均T线荧光值。(3)最佳保护液的确定:将偶联好的免疫微球复合物，分别用4种保护液进行复溶：①0.05 mol/L pH8.0硼酸缓冲液、1%T-20、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、4%海藻糖、0.05%NaN3；②0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液、1%T-20、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、4%海藻糖、0.05%NaN3；③0.05 mol/L pH8.0硼酸缓冲液、0.5%T-20、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、4%海藻糖，0.05%NaN3；④0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液、0.5%T-20、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、4%海藻糖、0.05%NaN3。按1.2.1方法制备4种条件的试纸条，用100 ng/ml的质控品重复检测3条，取3次平均T线荧光值并在紫外分析仪下观察4个条件荧光现象。

2 结果

2.1EDC量的确定 见表1，在加入EDC 160 μg条件下，线性最好，最佳线性范围3.125～600 ng/ml，R2=0.980 3。

2.2标记蛋白量与标记时间的确定 见表2，随着蛋白标记量的增加，T线荧光值逐渐上升；随着标记时间增长，T线荧光值先升后降。标记蛋白量125 μg，标记1.5 h时，T线荧光值最高。最佳标记蛋白量125 μg，标记1.5 h。

表15种EDC量的线性关系

Tab.1LinearrelationshipbetweenfivekindsofEDCquantities

LinearEDC dosage40 μg80 μg160 μg240 μg320 μgLinear range(ng/ml)6.25-4003.125-5003.125-6006.25-5006.25-500R20.943 20.926 40.980 30.904 50.877 9

表2蛋白标记量与标记时间的检测结果

Tab.2Testingresultsofproteinlabelingandlabelingtime

Proteinlabeling(μg)Labeling time(h)0.511.52757 2387 4828 4448 5321007 4517 5368 4958 4871257 7647 6549 1018 8051507 8328 2348 5788 634

图1 不同保护液检测结果Fig.1 Different protective fluid testing resultsNote: 1.Borate buffer+1%T-20；2.Tris-HCl buffer+1%T-20；3.Borate buffer+0.5%T-20；4.Tris-HCl buffer+0.5%T-20.

图2 紫外分析结果Fig.2 UV analysis testing results

2.3最佳保护液的确定 两种缓冲液相比，Tris-HCl缓冲液复溶效果最好，Tris-HCl缓冲液T线荧光值比硼酸缓冲液荧光值高(图1)；通过改变T-20的含量，试纸条上聚集现象明显减少(图2)。最终确定4号为最佳保护液。

2.4标准曲线与灵敏度 见图3，线性范围在3.125～600 ng/ml，R2=0.984 1。最低检出限0.9 ng/ml。

图3 标准曲线Fig.3 Standard curve

图4 荧光层析法和ELISA法的相关性结果Fig.4 Linear correlation between two methods testing Fluorescence immunochromatography and ELISA

2.5精密度 通过M1=12.5 ng/ml、M2=50 ng/ml、M3=200 ng/ml质控品检测，批内变异系数分别为6.46%、6.09%、5.42%，批间变异系数分别为9.89%、7.58%、7.37%，均满足批内小于10%，批间小于15%的要求。

2.6方法学比对 结果见图4，线性回归方程为：y=1.016 4x+11.825，R2=0.979 5，表明这两种检测方法具有良好的相关性。

3 讨论

继胶体金免疫层析技术(GICA)之后[11]，荧光免疫层析技术因快捷，既可定性、又可定量，成为床旁快检技术(POCT)领域发展的必然趋势[12]。通过对本技术系统研究，确定本研究偶联过程EDC 160 μg，蛋白标记量与偶联时间为125 μg、1.5 h。在本研究中，发现荧光微球聚集影响因素众多，其关键性问题是解决微球聚集。添加表面活性剂，能够增加亲水性，会影响抗原抗体结合后的流速。表面活性剂在0.2%～2%的浓度范围内，能够增强抗原抗体的特异性结合，更助于样品释放，从而提高试纸条灵敏度，也能减少试纸条上微球聚集。本研究通过借助调整保护液中的缓冲体系、表面活性剂，减少试纸条免疫微球聚集，为荧光免疫层析技术的完善提供一种参考。本方法与国外ELISA法诊断试剂对比，相关性高，为冠心病的临床诊断提供一种新的手段，具有较高的临床应用价值。