纸层析法分离叶绿体色素方法的低毒优化

吕亚慈

（衡水学院生命科学学院 河北 衡水 053000）

叶绿体色素是植物吸收太阳光进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿b、胡萝卜素和叶黄素组成。分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等，纸层析是其中较简单的一种，也是学生试验中提取分离叶绿素的常用方法。但此方法使用较多的有毒试剂，如丙酮、CCl4等，存在层析时间长、分离效果较差等不足之处。所以，本文针对上述缺点对试验进行优化。

1 试验方法

影响叶绿体色素层析试验效果主要有三个因素：对材料的处理、提取溶剂的选择、层析剂的选择。可以通过逐一改变其影响因素(其他的和对照组相同)的方法分别测出在这三个因素方面的最优良做法，从而获得一个优化后的分离方法。

1.1 材料的处理。称取新鲜、去大叶脉的菠菜叶，按2 g/组称取3组，分别对这3组材料做以下处理：①直接研磨，不做任何处理(传统做法，为对照组)。②投入沸水中(30～40 s)后，立即放入冷水中(数秒)，捞出后用吸水纸吸干水分[1]。③在烘箱内(48℃)烘干约半小时[2]，待材料处理好以后分别剪碎放入3个研钵中，加入少量的CaCO3(中和细胞中的酸，防止Mg2+从叶绿素中释放)和石英砂进行研磨，成匀浆后再加入10 ml丙酮，然后用漏斗过滤，得到3瓶叶绿体色素提取液，并标号。后续采用相同的方法：圆形滤纸点样，长7 cm、宽2 cm的滤纸条卷成纸捻，让纸捻浸泡在CCl4+无水Na2SO4的层析液中进行层析，观察试验结果[3]。

1.2 提取液的选择。合适的提取液能有效地提高色素的提取量，保证分离时会有好的效果。取去大叶脉的菠菜叶，按2 g/组称取4组，剪碎并放入研钵中，加入少量的CaCO3和石英砂进行研磨，待成匀浆后，分别加入丙酮(传统做法，为对照组)、乙醇、丙酮+石油醚(2滴)、乙醇+石油醚(2滴)，4种提取液均为10 ml，过滤，得到4种叶绿体色素液，并标号。经过点样、层析等相同步骤后，观察试验结果。

1.3 层析液的选择。合适的层析剂使色素带的分布更清晰，也能节省试验时间。本试验设置了不同的层析液：①CCl4加少量无水Na2SO4，作为对照组。②石油醚和CCl4，其比例为2∶1。③石油醚和苯，其比例为3∶1。④石油醚与苯，其比例为2∶1。用传统的方法处理4组材料，研磨成匀浆后，加入10 ml的丙酮，过滤，得到叶绿体色素液。点样用上述4种不同层析液进行层析，标号并记时。

2 试验结果

2.1 选择最优的材料处理。利用分光光度计对3种色素提取液进行测量，根据Lambert-Beer定律计算叶绿素含量，其结果如下：处理1：A663=1.023；A645=0.361Ct=15.500 mg/L；处理2：A663=1.013；A645=0.363Ct=15.461 mg/L；处理3：A663=0.925；A645=0.328Ct=14.047 mg/L

从以上数据可以看出：两组值中，处理1与处理2均较为接近，处理3最小；再结合层析得到的结果，可以判断出处理1与处理2对叶绿素的提取量较大，而处理2更有利于黄色素的提取。所以，本试验选择处理2的方法。

2.2 选择最优的提取液。通过观察层析结果得出：①丙酮：分离效果较好但是时间较长，丙酮有剧毒。②乙醇：价格低但是效果差。③丙酮+石油醚：提取较多的色素，分离效果较好，层析时间短，但是丙酮有剧毒。④乙醇+石油醚：提取较多的色素，分离效果好，层析时间短，成本较低。试验结论：在加了石油醚的提取液中，能提取出较多的色素，其中以黄色素最为明显。虽然丙酮作为提取液的分离效果较好，但由于丙酮有毒，而乙醇替代丙酮后试验效果也很不错，最终本试验选择了乙醇+石油醚作为最佳的提取液。

2.3 选择最适的层析液。试验结果：①CCl4+无水NaSO4(对照)：层析效果一般且用时最长。②石油醚+CCl4：层析效果一般且用时较长。③石油醚+苯：效果较好，用时较短。④石油醚+苯：效果较好，用时最短。因此，在用石油醚和苯以2∶1比例混合作层析剂时，层析的时间最短、层析的效果也是最好的。

3 最优的试验方案

通过本试验，最终确定了一套从材料处理、提取液与层析剂的改进等方面较传统方法更优化的分离叶绿体色素的方法，具体步骤如下：①称取2 g去大叶脉的新鲜菠菜叶，将其投入沸水中30～40 s，捞出后立即放入冷水中，数秒后捞出，用吸水纸吸干水分。②将处理好的材料剪碎放入研钵中进行研磨，待研磨成匀浆后加入乙醇与2滴石油醚，共10 ml，过滤，得到叶绿体色素提取液。③点样：用毛细吸管吸取提取液，在滤纸条的靠上方点上密集的点或划细线，然后用电吹风吹干(或自然晾干)，重复点样6～7次。④做纸捻：再将纸条卷成纸筒，用剪刀将下端没有点样的部分剪成小刷子状，做成纸捻。⑤层析：将做好的纸捻分别插入到已在圆心处开好孔的圆形滤纸上，以石油醚和苯2∶1比例的混合液作为层析剂，进行层析，19～23min后层析结束，得到清晰的色带。