长链非编码RNA HNF1A-AS1靶向has-miR-1对膀胱癌细胞生长和侵袭的调节作用及机制研究①

吴 克 邱明星 王 寓

(西南医科大学临床医学院，泸州646000)

膀胱癌是世界第九大常见恶性肿瘤，据统计，全球每年约有386 000例膀胱癌新发病例，并且其具有较高的复发率，导致多数患者预后较差[1-3]。膀胱癌预后的好坏与癌症的发展阶段密切相关，但多数患者由于在膀胱癌早期没有明显症状而延误治疗[4-6]。因此，寻找新的诊断指标和治疗方法是改善膀胱癌患者预后的关键。非编码RNA是一类不具有蛋白质编码功能的RNA，根据RNA大小可分为长链非编码RNA和短链非编码RNA两类[7,8]。近年来研究表明，非编码RNA在癌症的发生发展过程中发挥着重要作用[9-12]。其中，长链非编码RNA HNF1A-AS1参与了膀胱癌的发生发展。研究表明，HNF1A-AS1可通过靶向调控miR-30b-5p促进膀胱癌细胞增殖[13]。短链非编码RNA miR-1过表达能明显抑制膀胱癌细胞增殖并降低癌细胞运动能力[14]。并且生物信息预测发现HNF1A-AS1和miR-1之间可能存在靶向关系，但HNF1A-AS1和miR-1两者在调控膀胱癌细胞增殖和侵袭过程中是否存在靶向调控关系还未见报道。因此，本文将探究沉默HNF1A-AS1对膀胱癌细胞增殖及侵袭的作用及其与miR-1的关系。

1 材料与方法

1.1材料 膀胱癌细胞系HT-1376、RT112、253J和正常泌尿道上皮细胞系SV-HUC-1购自中国科学院上海细胞库；实验所用的HNF1A-AS1 shRNA、miR-1 mimic和miR-1 inhibitor均购自美国Invitrogen公司；MEM培养液、DMEM培养液、胰酶和胎牛血清均购自美国Gibco公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；细胞转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；Dual Luciferase报告基因试剂盒购自美国Promega公司；TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自美国ThermoFisher公司；MTT试剂盒和BCA试剂盒购自碧云天生物科技公司；Ki67、增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和内皮细胞生长因子(Endothelial cell growth factor,VEGF) 一抗及HRP标记的山羊抗小鼠二抗均购自英国Abcam公司；半干转膜仪、PCR仪和电泳仪购自Bio-Rad公司；酶标仪购自德国BMG Labtech公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 HT-1376细胞用含有10%胎牛血清的MEM培养基进行培养。RT112、253J和SV-HUC-1细胞用含10%的DMEM培养液进行培养，隔天换液，细胞汇合率达到80%时进行传代。

1.2.2细胞转染 将253J细胞传代培养于6孔板中，培养24 h后，用慢病毒转染HNF1A-AS1，并根据转染试剂盒说明书用Lip 3000分别或同时转染HNF1A-AS1 shRNA、miR-1 mimic或miR-1 inhibitor，转染48 h后用荧光定量进行检测。

1.2.3MTT检测细胞活性 将细胞传代接种于96孔板中并随机分为miR-1 mock组、HNF1A-AS1 shRNA组、miR-1 inhibitor组和shRNA+ miR-1 inhibitor组，用miR-1 inhibitor和shRNA分别或同时进行转染后，每孔加入20 μl MTT试剂于37℃继续孵育4 h后，加入150 μl DMSO，充分混匀后用酶标仪检测细胞吸光度。

1.2.4侵袭实验 将细胞用无血清培养液培养24 h后，以2×105个/ml的浓度将细胞接种于提前用Matrigel预包被的Transwell小室中，用无血清培养液培养，小室下层加入含血清的正常培养液，培养48 h后用棉签擦去上层细胞，用结晶紫对下层细胞进行染色并统计。

1.2.5荧光素酶报告实验 通过生物信息学预测HNF1A-AS1在miR-1上的结合位点。PCR扩增miR-1中含有HNF1A-AS1结合位点的片段，并将该片段插入pMIR-REPORT载体。用miR-1野生型质粒、miR-1突变型质粒和HNF1A-AS1分别或同时转染细胞后，根据Dual Luciferase报告基因试剂盒说明书测定荧光强度，并以突变质粒作对照。

1.2.6荧光定量检测 用TRIzol试剂盒提取各组细胞总RNA。根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA，对cDNA进行扩增后用荧光定量试剂盒对其进行定量分析。以GAPDH为内参，实验所用的引物序列如下：HNF1A-AS1上游引物：5′-TCAAGAAATGGT-GGCTAT-3′，下游引物：5′-GATCTGA-GACTGG-CTGAA-3′；miR-1上游引物：5′-GATCCCCTGGAATGTAAAGAAGTATGTATTTCAAGAGAATACATACTTCTT-TACATTCCATTTTTA-3′， miR-1下游引物：5′-TCGATAAAAATGGAATGTAAAGAAGTATGTATTCT-CTTGAAATACATACTTCTTTACATTCCAGGG-3′；GA-PD-H上游引物：5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，下游引物：5′-GACAAGCTTCCCTT-CTCAG-3′。

1.2.7免疫印迹 用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白。用BCA试剂盒检测蛋白浓度后调平。用10%SDS-PAGE分离蛋白并转移蛋白至PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h后，加入一抗4℃封闭过夜。第二天弃去一抗并洗涤3次后加入相应二抗，室温孵育1 h。最后滴加ECL显色液于暗室曝光显影，用Image J软件对蛋白质条带进行定量分析，以GAPDH为内参。

2 结果

2.1HNF1A-AS1和miR-1在膀胱癌细胞系中的表达 为了探究HNF1A-AS1、miR-1与膀胱癌的关系，我们首先检测了HNF1A-AS1和miR-1在多种膀胱癌细胞系中的表达情况。与正常泌尿道上皮细胞比较，膀胱癌细胞系HT-1376、RT112和253J的HNF1A-AS1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01，图1)，miR-1表达水平明显降低(P<0.01，图1)，并且以253J细胞变化最显著。因此，选其进行后续实验。

2.2HNF1A-AS1对miR-1表达的影响 实验结果表明，HNF1A-AS1过表达可显著降低膀胱癌细胞miR-1的表达水平，还可显著减弱miR-1 mimic对miR-1表达的促进作用(P<0.05，图2A)。此外，下调HNF1A-AS1表达可显著促进235J细胞miR-1的表达(P<0.05)，并能明显减弱miR-1 inhibitor对miR-1表达的抑制作用(P<0.05，图2B)，表明HNF1A-AS1可影响膀胱癌细胞miR-1的表达。

2.3HNF1A-AS1靶向结合miR-1 为了探究HNF1A-AS1和miR-1之间是否存在靶向关系，我们通过生物信息预测了两者之间的靶向关系。如图3所示，miR-1基因序列上存在连续的HNF1A-AS1的结合位点。荧光素酶报告实验进一步表明，HNF1A-AS1过表达能显著减弱带有miR-1片段野生型质粒的荧光素酶活性(P<0.05，图3)，结合位点突变后，调控关系消失，表明HNF1A-AS1和miR-1之间存在靶向调控关系。

2.4沉默HNF1A-AS1对膀胱癌细胞增殖的影响MTT实验结果表明，与miR-1 mock组比较，miR-1 inhibitor组细胞活性明显增高，shRNA组细胞活性明显降低(P<0.05，图4)；与shRNA组比较，shRNA+miR-1 inhibitor组细胞活性明显升高(P<0.05，图4)；同时，沉默HNF1A-AS1表达能显著抑制膀胱癌细胞增殖相关蛋白Ki67和PCNA的表达(P<0.05，图5)，抑制miR-1表达可明显促进Ki67和PCNA表达(P<0.05，图5)， 并可显著减弱shRNA对Ki67和PCNA表达的抑制作用(P<0.05，图5)。

图1 HNF1A-AS1和miR-1在膀胱癌细胞系中的表达Fig.1 Expressions of HNF1A-AS1 and miR-1 in bladder cell linesNote: n=6,**.P<0.01 versus SV-HUC-1 group.

图2 HNF1A-AS1对miR-1表达的影响Fig.2 Effects of HNF1A-AS1 on expression of miR-1Note: n=6.*.P<0.05.

2.5沉默HNF1A-AS1对膀胱癌细胞侵袭能力的影响 与miR-1 mock组比较，shRNA组膀胱癌细胞侵袭相关蛋白MMP-9和VEGF的蛋白表达水平显著降低(P<0.05，图5)，miR-1 inhibitor组MMP-9和VEGF表达水平明显升高(P<0.05，图5)；与shRNA组比较，shRNA + miR-1 inhibitor组MMP-9和VEGF表达水平明显升高(P<0.05，图5)。此外，shRNA组细胞侵袭数较miR-1 mock组明显减少(P<0.05，图6)，miR-1 inhibitor组细胞侵袭数明显增多(P<0.05，图6)；与shRNA组比较，shRNA + miR-1 inhibitor组细胞侵袭数显著增多(P<0.05，图6)。

图3 HNF1A-AS1靶向结合miR-1Fig.3 HNF1A-AS1 targeted combinates with miR-1Note: n=6,*.P<0.05 versus hsa-miR-1 wt group.

图4 沉默HNF1A-AS1对膀胱癌细胞增殖的影响Fig.4 Effect of silencing HNF1A-AS1 on cell proliferation of bladder cancer cells Note: Cells were transferred with shRNA and miR-1 inhibitor and cell viability was measured by MTT.n=6,*.P<0.05 versus miR-1 mock,#.P<0.05 versus shRNA.

图5 沉默HNF1A-AS1对膀胱癌细胞增殖和侵袭相关蛋白表达的影响Fig.5 Effects of silencing HNF1A-AS1 on cell prolifer-ation-and invasion-related proteins of bladd-er cancerNote: GAPDH was used as loading control,n=6.*.P<0.05,**.P<0.05,versus miR-1 mock group；#.P<0.05 versus shRNA group.

图6 沉默HNF1A-AS1对膀胱癌细胞侵袭能力的影响Fig.6 Effect of silencing HNF1A-AS1 on cell invasion of bladder cells Note: n=6,*.P<0.05 versus miR-1 mock group；#.P<0.0 versus shRNA group.

3 讨论

非编码RNA是指一类不参与蛋白质编码的RNA，根据其大小可分为长链非编码RNA和短链非编码RNA[15]。既往研究发现，非编码RNA具有多种生物学功能，其可调控基因、蛋白质表达和机体的能量代谢，同时也参与了癌症的发生和发展[15-17]。研究表明，非编码长链RNA HNF1A-AS1在多种癌症中呈高表达状态，其与癌症患者的预后呈负相关[18-20]。而miR-1在多种癌症中呈低表达状态[21-23]。在本研究中，首先检测了HNF1A-AS1和miR-1在多种膀胱癌细胞系中的表达情况，结果发现HNF1A-AS1在多种膀胱癌细胞系中的mRNA表达水平均高于正常泌尿道上皮细胞，miR-1的表达水平均低于正常泌尿道上皮细胞，并且以253J细胞HNF1A-AS1和miR-1的表达变化最大，因此选择253J细胞系进行后续实验。

研究表明长链非编码RNA HNF1A-AS1可通过调控多种非编码RNA的表达影响癌症的发生和发展。HNF1A-AS1可通过上调长链非编码RNA H19的表达诱导食管癌的发生[24]，其还可通过抑制miR-34a下调SIRT1/p53反馈回路促进结肠癌细胞的转移[20]。也有研究报道表明，HNF1A-AS1还可通过下调miR-30b-5p诱导凋亡相关蛋白Bcl-2表达，从而促进肝癌细胞和膀胱癌细胞增殖、抑制癌细胞凋亡，促进癌症的发生发展[13,19]。miR-1是一类抑癌基因，其过表达可降低膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力[25]。但HNF1A-AS1是否可通过靶向调控miR-1的表达影响癌症的发展还未见报道。本文研究发现，HNF1A-AS1过表达可显著抑制膀胱癌细胞miR-1的表达，还可显著减弱miR-1 mimic诱导miR-1表达的作用。沉默HNF1A-AS1可促进膀胱癌细胞miR-1表达，减弱miR-1 inhibitor对miR-1表达的抑制作用，提示HNF1A-AS1和miR-1之间可能存在靶向调控关系。为了进一步验证HNF1A-AS1和miR-1之间的关系，本文首先通过生物信息系统预测了HNF1A-AS1和 miR-1之间的靶向关系。结果表明，miR-1基因序列上存在HNF1A-AS1的结合位点，并且荧光素酶报告实验结果也表明HNF1A-AS1和 miR-1之间存在靶向调控关系，提示HNF1A-AS1可能通过调控miR-1的表达影响膀胱癌的发展。

HNF1A-AS1过表达可增强膀胱癌细胞的增殖和运动能力，miR-1可通过调控长链非编码RNA UCA1的表达抑制膀胱癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡[13,14,26]。在上述实验中，上文已经证明HNF1A-AS1可靶向调控miR-1，因此，本文进一步探究了HNF1A-AS1对膀胱癌细胞增殖和侵袭能力影响与其调控miR-1表达的关系。通过实验发现，沉默HNF1A-AS1表达能显著抑制253J细胞活性，并可显著抑制Ki67和PCNA的表达，下调miR-1表达可提高膀胱癌细胞活性，促进Ki67、PCNA表达，与之前文献报道一致[13,14]。同时，miR-1 inhibitor还可显著减弱shRNA对细胞增殖的抑制作用，表明沉默HNF1A-AS1可通过靶向调控miR-1表达抑制膀胱癌细胞增殖。此外，shRNA还可显著抑制膀胱癌细胞侵袭、MMP-9和VEGF的表达，miR-1 inhibitor可明显减弱shRNA对癌细胞侵袭和相关蛋白表达的抑制作用。MMP-9是基质金属蛋白酶家族一员，主要参与细胞基质的降解，促进细胞转移[27]。VEGF主要参与新血管的形成，也能通过促进细胞外基质的降解促进细胞转移[28]。实验结果表明，沉默HNF1A-AS1可通过上调miR-1表达降低膀胱癌细胞侵袭能力。

综上所述，HNF1A-AS1可靶向调控膀胱癌细胞miR-1的表达，沉默HNF1A-AS1可通过诱导miR-1表达减弱癌细胞增殖和侵袭能力。本研究进一步探究了HNF1A-AS1影响膀胱癌发展的机制，可能为膀胱癌的治疗提供了新的思路。