长链非编码RNA MALAT1靶向miR-570-3p对人视网膜母细胞瘤细胞系SO-Rb50增殖、凋亡和侵袭的调控作用①

闫义涛 王晓丽 谷圆圆 任艳凡 胡俊喜

(新乡医学院第一附属医院眼科,新乡453003 )

视网膜母细胞瘤是儿童最常见的原发性眼内恶性肿瘤，占所有儿童期恶性肿瘤的3%[1]。视网膜母细胞瘤通常会出现白带病及斜视。在该疾病的晚期，儿童可能会表现出突出症、布眼症或低视症[2]。视网膜母细胞瘤会严重影响患者及家庭成员的心理健康，给社会经济带来沉重负担[3,4]。因此，加深视网膜母细胞瘤的研究迫在眉睫。长链非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)是一类长于200 bp的非编码RNAs。LncRNAs会影响细胞内平衡的各个方面，如细胞增殖、凋亡、迁移等，在肿瘤发生发展过程中起着重要作用。microRNA可以调节基因转录效率，抑制目标信使RNA翻译的起始和延伸，促进目标信使RNA衰变，降低从目标信使RNA合成的蛋白质的稳定性等。许多lncRNAs是通过与microRNA相互作用发挥作用[5-8]。细胞系SO-Rb50来源于一个53 d大没有视网膜母细胞瘤家族史，患左眼视网膜母细胞瘤的女孩。本研究的主要目的是探究lncRNA MALAT1对人视网膜母细胞瘤细胞系SO-Rb50增殖、凋亡和侵袭的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1细胞系与主要试剂 人视网膜母细胞瘤细胞系SO-Rb50来源于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。RPMI-1640培养基、胎牛血清及转染试剂TurboFect Transfection Regent购自赛默飞世尔科技公司。RNA提取试剂盒RNAiso Plus reagent和SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒购自大连TaKaRa公司。荧光素酶检测试剂盒来源于Promega公司。细胞凋亡检测试剂盒Annexin V Apoptosis Detection Kit购自美国BD公司。Transwell小室及人工基底膜购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与转染 SO-Rb50细胞于含10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI1640培养基中，置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。当细胞增殖到约80%时进行传代培养。SO-Rb50细胞分为4组：sh-Ctrl(对照)组，sh-MALAT1组，miR-570 inhibitor组和sh-MALAT1+miR-570 inhibitor组。sh-MALAT1是一段特异性序列，可以干扰MALAT1表达。按照转染试剂TurboFect Transfection Regent说明书将sh-MALAT1和miR-570 inhibitor分别或同时转染SO-Rb50细胞，转染shRNA scramble作为转染对照。

1.2.2实时定量PCR(Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR) 用RNA提取试剂盒提取总RNA后反转成cDNA，MALAT1上游引物：AAA GCAAGG TCT CCC CAC AAG，MALAT1下游引物：GGT CTG TGC TAG ATC。miR-570-3p上游引物：CGAAAACAGCAATTACCTTTGC，miR-570-3p下游引物：TGGTGTCGTGGAGTCG。U6为内参，根据SYBR Premix Ex TaqTM说明书进行qRT-PCR，用公式2-ΔΔCt计算相对表达量。

1.2.3荧光素酶分析 首先移去细胞培养板中的培养液后加入PBS洗涤细胞，弃去洗涤液后在孔中加入1×的细胞裂解液进行裂解。然后室温振荡5～10 min，3 000 r/min离心5 min，取上清进行发光测定。按照试剂盒说明书和仪器操作说明对待测样品进行发光值测定。

1.2.4肿瘤成球实验 用胰酶将待测细胞消化后，1 500 r/min离心5 min。弃上清，加入PBS吹散洗涤细胞。反复洗涤3次后加入培养基制成1×102个/ml的单细胞悬液。然后将上述细胞悬液接种于6孔板中进行肿瘤成球培养。

1.2.5流式细胞术 首先收集待测细胞，用1×的Binding buffer制成1×106个/ml的细胞悬液。然后用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，碘化丙啶(Propidium iodide，PI)染色15 min，最后流式细胞仪对染色的细胞进行检测。

1.2.6Transwell检测细胞侵袭 收集待测细胞后用添加1%胎牛血清的培养基将其制成细胞密度为1×106个/ml的细胞悬液，然后将细胞悬液加入铺有人工基底膜的Transwell的上室中，在下室中加入含20%胎牛血清的培养基。37℃培养24 h后用0.5%的结晶紫对上室底部细胞进行染色，同时用棉签将上室内侧的细胞除去。显微镜下观察并统计细胞数量。

1.3统计学分析 用SPSS16.0软件对各实验组数据进行ANOVA统计分析，显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1ShRNA干扰lncRNA MALAT1表达 通过qRT-PCR分析lncRNA MALAT1表达检测sh-MALAT1干扰效果。由图1可知，sh-Ctrl组与SO-Rb50中lncRNA MALAT1表达无明显差异。与SO-Rb50组相比，sh-MALAT1组lncRNA MALAT1表达明显降低。上述结果说明，sh-MALAT1已成功将人视网膜母细胞瘤细胞系SO-Rb50的lncRNA MALAT1沉默。

2.2LncRNA MALAT1负向调控miR-570-3p表达 利用qRT-PCR检测转染sh-MALAT1及miR-570 inhibitor后miR-570-3p表达。图2显示，转染sh-MALAT1后miR-570-3p表达明显增强，转染miR-570 inhibitor后miR-570-3p表达明显减弱。同时转染sh-MALAT1和miR-570 inhibitor会抑制sh-MALAT1导致的miR-570-3p表达的升高。由此可见，在人视网膜母细胞瘤细胞系SO-Rb50中，lncRNA MALAT1负向调控miR-570-3p表达。

2.3LncRNA MALAT1与miR-570-3p存在直接靶向关系 通过荧光素酶实验进一步验证lncRNA MALAT1与miR-570-3p的靶向关系。如图3所示，MALAT1野生型细胞与MALAT1突变体细胞荧光素酶活性无明显差异。在MALAT1野生型细胞中添加miR-570 mimic后荧光素酶活性明显降低。在MALAT1突变体细胞中添加miR-570 mimic则对荧光素酶活性无明显影响。以上结果表明，LncRNA MALAT1与miR-570-3p存在直接靶向关系。

2.4Sh-MALAT1通过miR-570-3p降低SO-Rb50细胞增殖 利用肿瘤成球实验分析sh-MALAT1对SO-Rb50细胞增殖的影响。由图4可知，sh-MALAT1组细胞数目明显少于对照组。miR-570 inhibitor组细胞数目明显多于对照组。

图1 qRT-PCR检测lncRNA MALAT1表达Fig.1 Expression of lncRNA MALAT1 was detected by qRT-PCRNote: n=5,repeated 3 times,ANOVA statistical analysis,significance level was equal to 0.05.Compared with So-Rb50 group and sh-Ctrl group,*.P<0.05.

图2 qRT-PCR检测miR-570-3p表达Fig.2 Expression of miR-570-3p was detected by qRT-PCRNote: n=5,repeated 3 times,ANOVA statistical analysis,significance level was equal to 0.05.Compared with added MALAT1 shRNA and miR-570 mock group, *.P<0.05；compared with added miR-570 mock group and MALAT1 shRNA and miR-570 inhibitor group, #.P<0.05.

与sh-MALAT1组相比，sh-MALAT1+ miR-570 inhibitor组细胞数目明显升高。由此可见，sh-MALAT1可通过提高miR-570降低SO-Rb50细胞增殖。

2.5sh-MALAT1通过miR-570-3p诱导SO-Rb50细胞凋亡 为分析sh-MALAT1对SO-Rb50细胞凋亡的影响，流式细胞术检测细胞凋亡。图5显示，sh-MALAT1组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。MiR-570 inhibitor组细胞凋亡率明显低于对照组。sh-MALAT1+ miR-570 inhibitor组细胞凋亡率则明显低于sh-MALAT1组。

图3 荧光素酶分析lncRNA MALAT1与miR-570-3p的靶向关系Fig.3 Targeted relationship of lncRNA MALAT1 and miR-570-3p was verified by luciferase assayNote: n=5,repeated 3 times,ANOVA statistical analysis,significance level was equal to 0.05.Compared with MALAT1 wt, MALAT1 mut and miR-570 mimic groups，*.P<0.05.

图4 肿瘤成球实验分析细胞增殖Fig.4 Cell proliferation was analyzed by tumorsphere formation assayNote: n=5,repeated 3 times,ANOVA statistical analysis,significance level was equal to 0.05.Compared with miR-570 inhibitor group, *.P<0.05；compared with sh-Ctrl group and sh-MALAT1+inhibitor group, #.P<0.05.

图5 流式细胞术检测细胞凋亡Fig.5 Apoptosis was measured by flow cytometryNote: The Q4 quadrant is apoptotic cell,n=5,repeated 3 times,ANOVA statistical analysis,significance level was equal to 0.05.Compared with sh-MALAT1 group,*.P<0. 05;compared with sh-Ctrl and sh-MALAT1+inhibitor groups,#.P<0. 05.

图6 Transwell检测细胞侵袭Fig.6 Cell invasion was detected by TranswellNote: n=5,repeated 3 times,ANOVA statistical analysis,significance level was equal to 0.05.Compared with miR-570 inhibitor group,*.P<0.05; compared with sh-Ctrl and sh-MALAT1+inhibitor group, #.P<0. 05.

上述结果表明，sh-MALAT1可通过提高miR-570增强SO-Rb50细胞凋亡。

2.6Sh-MALAT1通过miR-570-3p减弱SO-Rb50细胞侵袭 通过Transwell检测细胞侵袭，分析sh-MALAT1对SO-Rb50细胞侵袭的影响。由图6可知，sh-MALAT1组平均每个视野下侵袭细胞数目明显少于对照组。MiR-570 inhibitor组平均每个视野下侵袭细胞数目明显多于对照组。与sh-MALAT1组相比，sh-MALAT1+ miR-570 inhibitor组平均每个视野下侵袭细胞数明显增多。以上结果说明，sh-MALAT1可通过提高miR-570减弱SO-Rb50细胞侵袭。

3 讨论

目前对视网膜母细胞瘤的治疗手段主要包括体外放射治疗，全身化疗，激光光凝术及眼动脉化学外科联合玻璃体内化疗等，但这些治疗方法都存在一些缺陷[8,9]。越来越多的研究表明lncRNAs在癌症进程中发挥着重要作用，具有成为癌症靶向治疗的潜能[10]。

大量文献报道lncRNAs常常与microRNAs存在直接靶向关系。有数据显示lncRNA H19可通过与miR-17-92相互作用调控视网膜母细胞瘤进程[11]。有研发现在视网膜母细胞瘤 Y79细胞中lncRNA MALAT1可直接靶向miR-124[12]。此外，在肾脏透明细胞癌、肾癌及膀胱癌中，lncRNA MALAT1还可负向调控miR-200s、miR-205和miR-125b表达[13-15]。据报道在食管鳞状细胞癌细胞中lncRNA MALAT1表达与miR-101和miR-217表达呈负相关[16]。本研究表明，在人视网膜母细胞瘤细胞SO-Rb50中，lncRNA MALAT1负向调控miR-570-3p表达，lncRNA MALAT1与miR-570-3p存在直接靶向关系。

细胞过度增殖是癌症的常见特征。lncRNAs在调控细胞增殖方面具有重要作用。有研究显示沉默视网膜母细胞瘤Weri-Rb1细胞和Y79细胞的lncRNA BANCR会降低细胞增殖[17]。Wang等[18]发现在胆囊癌细胞中干扰lncRNA MALAT1可通过miR-363-3p减弱细胞增殖。据报道在骨肉瘤细胞中沉默lncRNA MALAT1会通过miR-142-3p和miR-129-5p抑制细胞增殖[19]。有研究表明在绒毛膜癌细胞中，干扰lncRNA MALAT1表达会导致细胞增殖下降，但miR-218 inhibitor会抵消干扰lncRNA MALAT1对细胞增殖的抑制作用[20]。本文结果显示，sh-MALAT1可抑制人视网膜母细胞瘤SO-Rb50细胞增殖，miR-570 inhibitor会逆转sh-MALAT1对细胞增殖的抑制。这说明，sh-MALAT1可通过提高miR-570降低SO-Rb50细胞增殖。

大量研究表明lncRNAs可调控癌细胞凋亡。Zhang等[21]发现在视网膜母细胞瘤SO-Rb50细胞和Y79细胞中，干扰lncRNA CCAT1可通过负向调控miR-218-5p提高细胞凋亡。据报道在膀胱癌细胞、肝癌细胞及骨肉瘤细胞中干扰lncRNA MALAT1可通过miR-125b、miR-195和miR-509提高细胞凋亡[22-24]。另外，沉默神经胶质瘤细胞及胃癌细胞的lncRNA MALAT1后，细胞凋亡会增加，下调miR-101和miR-202表达会逆转沉默lncRNA MALAT1对细胞凋亡的促进作用[25,26]。本研究结果表明，sh-MALAT1可促进人视网膜母细胞瘤SO-Rb50细胞凋亡，miR-570 inhibitor会抵消sh-MALAT1对细胞凋亡的促进。由此可见，sh-MALAT1可通过提高miR-570增强SO-Rb50细胞凋亡。

细胞侵袭在癌症进程中发挥重要作用。越来越多的研究表明lncRNAs会影响癌细胞侵袭能力。Dong等[27]发现干扰视网膜母细胞瘤Y79细胞中lncRNA HOTAIR表达可抑制细胞侵袭。据报道在视网膜母细胞瘤 Y79细胞中沉默lncRNA MALAT1可通过靶向miR-124抑制细胞侵袭[28]。有研究发现在肝癌细胞、三阴乳腺癌细胞和胆囊癌细胞中干扰lncRNA MALAT1表达可抑制细胞侵袭，miR-204 inhibitor、miR-129 inhibitor和miR-206 inhibitor会逆转干扰lncRNA MALAT1对细胞侵袭的抑制作用[29-31]。在宫颈癌细胞中，siRNA干扰lncRNA MALAT1可通过靶向miR-214减弱细胞侵袭[32]。本文结果显示，sh-MALAT1可抑制人视网膜母细胞瘤SO-Rb50细胞侵袭，miR-570 inhibitor会减弱sh-MALAT1对细胞增殖的抑制。这说明，sh-MALAT1可通过提高miR-570降低SO-Rb50细胞侵袭。

本研究表明，在视网膜母细胞瘤SO-Rb50细胞中，lncRNA MALAT1负向调控miR-570-3p表达，lncRNA MALAT1与miR-570-3p存在直接靶向关系。ShRNA干扰lncRNA MALAT1可促进细胞凋亡，抑制细胞增殖和侵袭，miR-570 inhibitor会减弱sh-MALAT1对细胞凋亡的促进和对细胞增殖和侵袭的抑制。综上所述，shRNA干扰lncRNA MALAT1会通过miR-570-3p提高人视网膜母细胞瘤细胞系SO-Rb50凋亡，降低细胞增殖和侵袭。下一步计划在体内研究lncRNA MALAT1对视网膜母细胞瘤发生发展的影响。