芦荟苷对非小细胞肺癌的增殖和抗转移作用①

刘 萍 韩达斌 马金华 刘 慧 雷 娇

(青海大学附属医院药剂科，西宁810001)

肺癌是迄今为止世界上最常见的恶性肿瘤。全世界每年有近百万人死于肺癌，中国近60万人死于肺癌及其并发症[1,2]。虽然目前在临床和肿瘤实验方面取得了很多进展，但肺癌的诊断和治疗仍不尽如人意，5年总生存率仅为11%[3,4]。其中非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)在肺癌中的发病率最高，约占肺肿瘤的85%[5]。由于肿瘤细胞在体内增殖和转移的具体机制相对复杂，临床上对出现转移的非小细胞肺癌的诊断时机受到一定的限制[6]。一般而言，化疗联合手术切除是非小细胞肺癌的经典治疗策略[7]。然而，化疗总是伴有一些严重的副作用，如白细胞减少、肝功能不全和肾功能紊乱[8]。因此，需要更安全的治疗策略和更彻底的研究来改善非小细胞肺癌的治疗现状。

芦荟苷也被命名为芦荟酵素(C21H22O9)，是一种天然的生物活性蒽环类抗生素。通常从芦荟叶中提取纯净的芦荟苷[9]。相关报告显示芦荟苷具有抗炎、抗菌、抗氧化活性，抗病毒和抗癌潜力[10]。此外，之前的研究发现了芦荟苷在调节人类恶性肿瘤(如结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌等)细胞周期阻滞和凋亡中的有效作用。已经证明芦荟苷能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞和人卵巢癌细胞系HO-8910PM的侵袭和转移行为[11,12]。上述研究说明了芦荟苷在抑制恶性肿瘤增殖和转移中的潜力。此外，其他研究人员提出，芦荟苷通过p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)-NF-κB依赖性途径下调MMP-2的表达，从而抑制鼻咽癌细胞的侵袭[13]。从而确定p38是芦荟苷诱导NSCLC H460细胞凋亡的重要决定因素。然而，没有具体研究显示非甾体抗炎药物中芦荟苷的抗癌潜力。

1 材料与方法

1.1细胞株及实验材料 芦荟苷和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)购自美国Sigma公司；p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR和GAPDH购自美国圣克鲁斯生物技术公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人非小细胞肺癌细胞获自武汉大学细胞培养物中心。细胞生长培养条件：10%FBS，50 μg/ml链霉素和50 μg/ml青霉素的培养基(MEM)，37℃，5%CO2进行孵育。

1.2.2定量实时聚合酶链反应(qPCR) qPCR使用TRIzol试剂盒从非小细胞肺癌患者和对照组织中提取总RNA。 用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒进行逆转录以合成cDNA有义链。然后在Real-time PCR系统中进行qPCR反应。 U6被视为内部控制参数。反应条件：95℃预变性10 min、95℃变性15 s、60℃退火32 s，循环50次后检测其溶解曲线，检测完成后，通过计算机系统自动分析各样本Ct值，然后采用2-ΔΔCt计算miRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.2.3测定细胞活力 细胞活力评估使用MTT细胞活性实验测定。用芦荟苷处理非小细胞肺癌细胞24 h后，去除培养基。使用MTT试剂在10%乙醇和0.1%试剂染液中对其进行处理，在室温下持续5 min，然后充分漂洗3次。使用95%乙醇提取，使用ELISA读数器测定吸光度。在相差显微镜下观察细胞，并使用DCM300数码相机拍照显微镜，计数并统计细胞活力数据。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 流式细胞术FITC-Annexin V/PI双染色被认为是理想的定量测定细胞凋亡的方法。将HCT116细胞以2×106细胞/孔的密度接种在6孔板中，生长24 h。使用芦荟苷处理细胞24 h后，加入100 μl细胞悬液5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，并将细胞在黑暗中孵育30 min。 PI(5 μl，浓度为10 μg/ml)加入细胞，在黑暗中再次孵育10 min。通过流式细胞术评估细胞以识别细胞周期的变化。细胞凋亡指数按照下列公式计算：PI%=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。

1.2.5细胞周期分析 细胞使用胰蛋白酶消化，调整至5×105～1×106个细胞/管，使用冰冷的磷酸盐缓冲液冲洗后，重悬在2 ml的乙醇中。在4℃孵育1 h后，除去乙醇将100 μl核糖核酸酶溶液(10 mg/ml)加入到每个试管中。然后将试管在室温下再培养30 min，并加入500 μl的分析溶液(PBS中的37 mmol/L EDTA和0.1%Triton X-100)，然后加入100 μl碘化丙锭溶液(400 μg/ml)。样品在4℃黑暗中保存，并使用流式细胞仪进行分析。

1.2.6Western blot 肺癌细胞在60 mm培养皿中培养，使用无血清培养基饥饿24 h，在指定的时间点用熊果苷处理。将样品在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用5%的Tween20的PBS中加入脱脂奶粉，孵育20 min，稀释度为1∶1 000的一抗孵育过夜，p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、p-H2AX、H2AX和GAPDH，然后与IRDye-结合的二抗在37℃温育1 h，室温下充分冲洗后，使用蛋白二抗孵育加强与一抗的蛋白反应。蛋白印迹的图像使用LAS-1000Lumino-图像分析仪。

2 结果

2.1芦荟苷的化学结构及浓度选择 芦荟苷可以抑制非小细胞肺癌细胞的生长。为了探讨芦荟苷对非小细胞肺癌细胞活性的影响，用不同浓度(0、10、50和100 μmol/L)的芦荟苷处理非小细胞肺癌A549细胞。图1显示了芦荟苷的结构。图2结果显示，即使在低浓度(10 μmol/L)时也测量到芦荟苷对A549细胞的抗增殖作用(P<0.05)，而较高浓度(50和100 μmol/L)的芦荟苷更明显降低了A549细胞的增殖水平(P<0.001)。结果显示，芦荟苷在较高浓度时可有效抑制非小细胞肺癌的细胞活力。

2.2芦荟苷对非小细胞肺癌细胞凋亡行为的影响 为了进一步研究芦荟苷对非小细胞肺癌细胞活性的影响，通过流式细胞术探讨芦荟苷诱导A549细胞凋亡和G2/M期细胞周期停滞。流式细胞术分析表明，用10 μmol/L芦荟苷处理的A549细胞中没有检测到显著的细胞凋亡差异，而50和100 μmol/L芦荟苷明显诱导细胞凋亡(P<0.01，图3)。

2.3芦荟苷对非小细胞肺癌细胞周期的影响 细胞周期分析表明，10 μmol/L芦荟苷引起G2/M期的积累(P<0.05)，50和100 μmol/L芦荟苷可以明显诱导G2/M期阻滞，G1期细胞比例相对下降，G2期细胞数目比例相对上升(P<0.01，图4)。表明随着芦荟苷药物浓度升高诱导的周期停滞相应明显(图4)。上述结果表明，芦荟苷可以在一定程度上诱导非小细胞肺癌细胞凋亡和细胞停滞行为。

2.4芦荟苷抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭和迁移前者的结果揭示了芦荟苷的抗活性作用，然后通过Transwell测定和划痕试验来研究芦荟苷对非小细胞肺癌细胞(A549)的细胞运动的影响。

图1 芦荟苷的生物分子结构Fig.1 Biological molecular structure of aloin glycosides

图2 不同浓度的芦荟苷对非小细胞肺癌细胞活性的影响Fig.2 Effect of different concentrations of aloin on activity of non-small cell lung cancer cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.001.

在A549细胞中，与加入10 μmol/L的芦荟苷相比，加入芦荟苷(50和100 μmol/L)的侵袭性细胞的数量减少了2倍以上(P<0.001，图5)。 划痕愈合实验测定的结果趋势与Transwell测定一致。 10 μmol/L芦荟苷组表现出迁移能力增强，而芦荟苷(50和100 μmol/L)使间隙增大约30%(P<0.01，图6)。上述结果提示芦荟苷对非小细胞肺癌细胞运动有明显的抑制作用。

图3 流式细胞术检测芦荟苷对非小细胞肺癌细胞凋亡行为的影响Fig.3 Flow cytometry assay of effect of aloin on apoptosis in non-small cell lung cancer cells

图4 芦荟苷对非小细胞肺癌细胞周期的影响Fig.4 Effect of aloin on cell cycle of non-small cell lung cancer

图5 芦荟苷对非小细胞肺癌细胞侵袭能力的影响Fig.5 Effect of aloin on invasion of non-small cell lung cancer cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.001.

图6 芦荟苷对非小细胞肺癌细胞侵袭能力的影响Fig.6 Effect of aloin glycosides on invasiveness of non-small cell lung cancer cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.001.

2.5芦荟苷抑制裸鼠非小细胞肺癌细胞的生长 实验结果显示，与对照组相比，芦荟苷可有效抑制肿瘤形成和肿瘤体积(图7A)。细胞增殖标志物(Ki-67和PCNA)的水平也在芦荟苷处理的小鼠组织中明显降低(图7B)。上述结果表明，芦荟苷可以在体内抑制非小细胞肺癌的肿瘤生长。

图7 芦荟苷抑制裸鼠非小细胞肺癌细胞的生长Fig.7 Aloin inhibits growth of non-small cell lung cancer cells in nude miceNote: A.The effect of aloin on the tumorigenicity of non-small cell lung cancer in nude mice;B.Expression levels of related proliferating proteins in tumor of nude mice.*.P<0.05.

3 讨论

肺癌是世界范围内恶性程度较高的肿瘤类型之一。在中国，45岁以下的肺癌患者的比率相对较高，非小细胞肺癌是最常见的肺癌类型[14]。目前，化疗联合手术切除是NSCLC治疗中最常用的方法。然而，肺癌的治疗仍不能令人满意，副作用和复发多。因此深入了解非小细胞肺癌发生、发展的分子机制，开发新的治疗方法至关重要[15]。近年来，天然草药产品由于其抗肿瘤活性，包括凋亡诱导和抗增殖活性而被用于治疗癌症。例如，根皮素诱导NSCLC A549细胞的凋亡[16]。苦参碱通过激活p38促进非小细胞肺癌细胞凋亡[17]。这些天然化合物有效地限制了恶性肿瘤的增殖，副作用小。

本研究中使用的芦荟苷是一种从芦荟中提取的天然化合物，已被证实在各种类型的恶性肿瘤中具有有效作用[17]。先前的研究证明，芦荟苷通过抑制血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)受体2和STAT3磷酸化的活化[18]，可以显著抑制体外人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的增殖，迁移和脉管形成。同样，在本研究中，芦荟苷有效地抑制细胞生长和增殖标志物(Ki-67和PCNA)的表达，特别是在较高浓度(50和100 μmol/L)时。这些结果表明芦荟苷可以抑制非小细胞肺癌细胞的存活能力。

相应的研究已经报道了芦荟苷的抗肿瘤存作用。有报道表明，芦荟和化疗联合应用可以提高肿瘤消退率和生存期的有效性[19]。有研究指出，芦荟苷和大黄素联用可以通过线粒体膜电位破坏促进人U87恶性胶质瘤细胞的细胞周期阻滞和凋亡行为进展[20]。在本研究中，用芦荟苷处理的肺癌A549细胞的细胞活力大大降低，随着浓度的增加，抑制率增加。此外，芦荟苷可以提升A549细胞的凋亡率，诱导G2/M期的积累。这与之前Alshatwi等[21]研究芦荟苷与细胞凋亡相关蛋白(caspase-3、caspase-8和caspase-9)的表达增加以及细胞周期关卡蛋白(p27、p53和细胞周期蛋白A)水平的改变趋势相一致，进一步证实了芦荟苷在A549细胞中的活性作用。上述结果表明，芦荟苷可以通过抑制非小细胞肺癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡和G2/M期细胞周期阻滞，从而抑制非小细胞肺癌细胞活性。同时芦荟苷也被认为具有抗转移作用。本研究得出了类似的结论。在芦荟苷处理下，A549细胞的侵袭和迁移能力受到很大的抑制。前述实验检测在用芦荟苷处理的A549细胞中，肿瘤转移相关蛋白(MMP-2、MMP-9、MMP-14和VEGF)的水平也降低，特别是在更高浓度(50和100 μmol/L)时[22]，以上结果提示了芦荟苷对非小细胞肺癌运动的整体抑制作用。

同时芦荟苷在体内也表现出肿瘤抑制作用。芦荟苷已被报道可以直接抑制前列腺癌细胞在无胸腺裸鼠模型中的生长[23]。体内研究注射人HER-2模拟物后，裸鼠肿瘤中显示芦荟苷抗肿瘤活性的阳性结果，证实芦荟苷可以明确抑制乳腺癌细胞的增殖生长[24]。在高转移性黑色素瘤B16-F10细胞中也观察到芦荟苷可以抑制黑色素瘤细胞的转移侵袭行为[25]。在这项研究中，有效的芦荟苷浓度可以干扰异种移植物中的肿瘤形成和肿瘤体积。此外，芦荟苷也可以抑制增殖标志物(Ki-67和PCNA)的表达水平，针对转移相关蛋白(MMP-9和VEGF)的表达水平尚未进行梯度浓度实验，后续实验可以进一步探讨相关转移通路途径和芦荟苷之间的关联，明确A549细胞凋亡及G2/M期细胞周期阻滞与细胞侵袭行为之间的相互关联。此外，芦荟苷通过抑制细胞运动，干扰A549细胞的侵袭和迁移能力及其水平可能是通过细胞骨架的转变形成，甚至可能通过抑制p38MAPK/Cdc25B/Hsp27途径参与肺癌的转移过程[26]。

综上所述，适合浓度的芦荟苷可以抑制非小细胞肺癌的增殖和侵袭行为，通过前面实验的结果，芦荟苷可能干扰病理状态下非小细胞肺癌的疾病进展，破坏A549细胞发生发展的必需途径，可能引起部分肿瘤细胞的转变，有可能为非小细胞肺癌的早期诊断和进展提供参考意见。