miR-582-5p靶向调控AKT3对甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡的影响

王玉君，林秀艳，王 涛

(1.海南省肿瘤医院核医学科，海南 海口 570311；2.齐齐哈尔医学院医药科学研究院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

甲状腺癌是常见的内分泌系统肿瘤，其发病率较高，约占恶性肿瘤的1.5%。甲状腺癌按照组织形态学可分为乳头状癌、滤泡状癌、髓样癌和未分化癌[1-2]。甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)占甲状腺癌的60%～80%，年龄分布较广，且呈现年轻化趋势[3-4]。PTC常出现淋巴结转移现象，属于分化型甲状腺癌，分化程度较高[5]。PTC起病隐匿，不易被发现，但是，相对于未分化甲状腺癌，PTC预后较好[6-7]。目前，PTC的治疗主要包括手术切除和碘-131(131I)治疗[8-9]。PTC对化学治疗药物不敏感，临床缺乏有效的化学治疗药物[10-11]。微小RNA(microRNA，miRNA或miR)是一种存在于真核生物中的非编码RNA，约由20～25个核苷酸组成，具有多种生物学功能[12]。研究表明，miRNA参与胃癌、骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、唾液腺样囊癌及结肠癌等多种肿瘤的发生和发展[13-20]。本研究旨在探讨miR-582-5p在人PTC组织中的表达及其靶向调控AKT3对PTC细胞增殖和凋亡的影响，以期为PTC的诊断和治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1标本来源选取2017年1月至2017年10月海南省肿瘤医院甲状腺外科手术切除的PTC组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘1～2 cm)标本各10例，男4例，女6例，年龄20～50(29.7±7.6)岁。所有患者术前未接受放射治疗和化学治疗，术后经病理学检查确诊。组织标本经甲醛固定，石蜡包埋保存。本研究通过医院医学伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书，自愿参与本研究。

1.2细胞、试剂与仪器人PTC K1细胞(广州吉妮欧生物科技有限公司)，高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、无血清Opti培养基(美国Hyclone公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，青霉素-链霉素混合液(双抗)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)、四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)试剂盒(德国Roche公司)，转染试剂Lipofectamine 2000(美国Santa Cruz公司)，40 g·L-1多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司)，TRIzol试剂、细胞培养箱、Nanodrop仪(美国Thermo公司)，RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂盒、反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，细胞培养板(美国Corning公司)，RIPA细胞裂解液(北京百泰克生物科技有限公司)，AKT3抗体、β-actin抗体(美国Abcam公司)，miR-582-5p mimics(miR-582-5p类似物)、miR-582-5p抑制剂miR-582-5p反义miRNA寡核苷酸(anti-miRNA oligonucleotide,AMO)及阴性对照物序列引物等均由上海吉玛生物科技有限公司设计并合成，低温高速离心机(湖南恒诺医用设备有限公司)，酶标仪(德国Tecan公司)，显微镜(日本Nikon公司)，细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1实时荧光定量PCR检测PTC组织和癌旁组织中miR-582-5p表达应用TRIzol试剂盒提取组织总RNA，并检测总RNA纯度。将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增，以磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参。引物序列：miR-582-5p上游引物序列为5′-GCACACATTGAAGAGGACAGAC-3′，下游引物序列为5′-TATTGAAGGGGGTTCTGGTG-3′；GAPDH上游引物序列为5′-TCCACTGGCGTCTTCACC-3′，下游引物序列为5′-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3′。PCR反应体系：10 μL SYBR Green、7 μL高压灭菌蒸馏水、1 μL cDNA和2 μL相应引物。PCR反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，连续进行40个循环；每个样本重复4次，采用2-△△Ct法获得miR-582-5p的相对表达量。

1.3.2细胞培养、转染及分组从液氮罐中取出PTC K1细胞，置于37 ℃水浴锅中快速晃动，1 min内融化冷存液，并转移至37 ℃培养液中，轻轻吹匀；1 000 r·min-1离心10 min，弃上清液。用适量培养液吹匀细胞沉淀，转移至细胞培养瓶中，置于37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱中继续培养。取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化，接种于6孔板中继续培养，待细胞生长融合度达到50%～60%时分为miR-582-5p mimics组、miR-582-5p AMO组、mimics对照组和AMO对照组，采用转染试剂脂质体Lipofect amine 2000和无血清Opti培养基进行细胞转染。转染前，弃去原培养液，加入无血清Opti培养基饥饿细胞2 h。转染6 h后更换新鲜培养液，继续培养细胞，24 h后收集4组K1细胞，进行后续实验。

1.3.3实时荧光定量PCR法检测4组K1细胞中miR-582-5p表达应用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA，并检测总RNA纯度。将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板进行扩增，以U6为内参。引物序列：miR-582-5p上游引物序列为5′-GCACACATTGAAGAGGACAGAC-3′，下游引物序列为5′-TATTGAAGGGGGTTCTGGTG-3′；U6上游引物序列为5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物序列为5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。PCR反应体系：10 μL SYBR Green、7 μL高压灭菌蒸馏水、1 μL cDNA和 2 μL 相应引物。PCR反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，连续进行40个循环；每个样本重复4次，采用2-△△Ct法获得miR-582-5p的相对表达量。

1.3.4MTT法检测4组K1细胞活性取各组转染后细胞，胰蛋白酶消化，接种于96孔板，调整细胞密度为每孔4×104个，每组设置6个复孔，分别于培养0、12、24、36、48 h后弃去培养液，每孔加入500 μL 0.5 g·L-1MTT溶液，37 ℃孵育4 h，每孔加入100 μL二甲基亚砜，避光条件下摇床轻轻摇晃1 min，继续孵育10 min，应用酶标仪于波长490 nm处测定各孔吸光度。

1.3.5平板克隆形成实验检测4组K1细胞克隆能力取各组转染后培养24 h的细胞，胰蛋白酶消化，接种于35 mm小皿中，每皿300个细胞，每组设置3个复皿，每3 d更换新鲜培养液，培养10 d后PBS清洗细胞3次，40 g·L-1多聚甲醛固定，1 g·L-1结晶紫溶液染色；以≥50个细胞作为1个克隆，计数各组细胞克隆数量。

1.3.6锥虫蓝染色检测4组K1细胞存活率取各组转染后细胞，接种于6孔板，24 h后用胰蛋白酶消化细胞，1 000 r·min-1离心10 min，弃上清液。向细胞沉淀中加入锥虫蓝染色液。应用细胞计数板在细胞计数仪上观察细胞，蓝染代表死亡细胞，计算细胞存活率。每组细胞重复3次，取均值。

1.3.7TUNEL法检测4组K1细胞凋亡情况取各组转染后细胞，接种于小皿中，接种密度为4×104cm-2，24 h后弃去小皿中的培养液，PBS洗涤，40 g·L-1多聚甲醛固定，山羊血清孵育1 h进行封闭，并用体积分数0.5%Triton溶液进行穿透，按照试剂盒说明书将Vial1和Vial2按照19的比例混合，用混合物避光孵育细胞1 h。PBS洗净后使用Hoechst染色液孵育细胞，并于倒置荧光显微镜下观察染色情况，拍照并计算细胞凋亡率。

1.3.8miR-582-5p靶基因预测利用TargetScan Human7.2在线软件(http://www.targetscan.org/vert_72/)预测人miR-582-5p的靶基因。从miR-582-5p的靶点基因中发现AKT3与人类多种肿瘤相关，如乳腺癌、胃癌、卵巢癌、甲状腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和结肠癌等。因此，推测miR-582-5p可能通过靶向调控AKT3的表达而发挥抑制PTC细胞增殖及促进其凋亡的作用。

1.3.9Westernblot法检测4组K1细胞中AKT3蛋白表达取各组转染后培养24 h的细胞，接种于6孔板，提取细胞中总蛋白，超声震碎并裂解蛋白，应用BCA试剂盒检测总蛋白浓度，加入蛋白样品、蛋白上样缓冲液和蒸馏水，混匀，在金属浴中煮沸，使蛋白质变性。将蛋白样本和Marker进行凝胶电泳分离，电泳结束后进行转膜、封闭和洗膜，加入AKT3抗体一抗(11 000稀释)，4 ℃过夜孵育，PBS洗涤3次，每次5 min，加入二抗(11 000稀释)，并进行扫膜。以β-actin为内参，检测AKT3蛋白相对表达量。

2 结果

2.1PTC组织和癌旁组织中miR-582-5p表达比较PTC组织和癌旁组织中miR-582-5p相对表达量分别为0.372±0.237、1.010±0.083，PTC组织中miR-582-5p相对表达量显著低于癌旁组织，差异有统计学意义(t=5.003，P<0.05)。

2.24组K1细胞中miR-582-5p表达比较miR-582-5p mimics组、mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞中miR-582-5p相对表达量分别为14.143±2.318、1.063±0.214、1.041±0.372、0.435±0.145；miR-582-5p mimics组细胞K1中miR-582-5p相对表达量显著高于mimics对照组、miR-582-5p AMO组和AMO对照组，差异均有统计学意义(t=4.834、4.975、7.163，P<0.05)。miR-582-5p AMO组K1中miR-582-5p相对表达量显著低于AMO对照组和mimics对照组，差异有统计学意义(t=5.916、5.619，P<0.05)；mimics对照组与AMO对照组K1中miR-582-5p相对表达量比较差异无统计学意义(t==30.715，P>0.05)。

2.34组K1细胞活性比较结果见表1和图1。细胞培养0 h时4组K1细胞活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。细胞培养12、24、36、48 h时，miR-582-5p mimics组K1细胞活性显著低于miR-582-5p AMO组、mimics对照组和AMO对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；miR-582-5p AMO组K1细胞活性显著高于mimics对照组和AMO对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；mimics对照组与AMO对照组K1细胞活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 4组K1细胞活性比较

注：与miR-582-5p AMO组、mimics对照组和AMO对照组比较aP<0.05；与mimics对照组和AMO对照组比较bP<0.05。

图1 4组K1细胞活性比较

2.44组K1细胞克隆形成能力比较mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组、miR-582-5p AMO组K1细胞克隆数量分别为18.47±5.25、5.10±4.97、19.53±6.45、32.63±7.74；miR-582-5p mimics组K1细胞克隆数量显著少于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组，差异有统计学意义(t=2.531、5.734、6.623，P<0.05)；miR-582-5p AMO组K1细胞克隆数量显著多于AMO对照组和mimics对照组，差异有统计学意义(t=3.193、5.853，P<0.05)；mimics对照组与AMO对照组K1细胞克隆数量比较差异无统计学意义(t=32.851，P>0.05)。

2.54组K1细胞存活率比较mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞存活率分别为(76.46±13.53)%、(42.64±10.85)%、(77.82±10.35)%、(83.63±13.53)%；miR-582-5p mimics组K1细胞存活率显著低于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组，差异有统计学意义(t=3.881、6.634、21.810，P<0.05)；miR-582-5p AMO组K1细胞存活率显著高于AMO对照组和mimics对照组，差异有统计学意义(t=2.482、11.871，P<0.05)；mimics对照组与AMO对照组K1细胞存活率比较差异无统计学意义(t=31.640，P>0.05)。

2.64组K1细胞凋亡率比较结果见图2。mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞凋亡率分别为(23.35±9.64)%、(42.63±13.38)%、(22.85±9.74)%、(10.84±3.64)%；miR-582-5p mimics组K1细胞凋亡率显著高于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组，差异有统计学意义(t=5.956，15.753、15.756，P<0.05)；miR-582-5p AMO组细胞凋亡率显著低于AMO对照组和mimics对照组，差异有统计学意义(t=6.840、7.862，P<0.05)；mimics对照组与AMO对照组K1细胞凋亡率比较差异无统计学意义(t=41.850，P>0.05)。

图2 4组K1细胞凋亡情况

2.74组K1细胞中AKT3蛋白表达比较结果见图3。mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞中AKT3蛋白相对表达量分别为1.000±0.005、0.531±0.162、1.010±0.071、1.432±0.141；miR-582-5p mimics组K1细胞中AKT3蛋白相对表达量显著低于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组，差异有统计学意义(t=8.933、22.34、15.110，P<0.05)；miR-582-5p AMO组K1细胞AKT3蛋白相对表达量显著高于AMO对照组和mimics对照组，差异有统计学意义(t=9.240、19.673，P<0.05)；mimics对照组与AMO对照组K1细胞AKT3蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(t=31.450，P>0.05)。

图3 4组K1细胞中AKT3蛋白表达(Western blot)

3 讨论

miRNA是一类高度保守的内源性非编码RNA，长度约22个核苷酸，广泛存在于病毒和高等生物，其能够通过碱基互补原理与靶基因的mRNA结合，降解靶基因的mRNA或抑制其翻译，在细胞的存活、分化、增殖和凋亡等过程中起着重要作用，并参与肿瘤等多种疾病的发生和发展[21-22]。本研究的目的是探究miR-582-5p在甲状腺癌组织和细胞中的表达以及miR-582-5p对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的作用，并分析其具体机制。本研究结果显示，miR-582-5p在甲状腺癌组织和细胞中表达显著下调；提示miR-582-5p可能参与甲状腺癌的发生和发展过程，且在甲状腺癌中是抑癌基因。但是，本研究样本量较小，尚不足以证明miR-582-5p可以作为甲状腺癌的生物标志物，有待增加样本量进一步证实，为甲状腺癌的诊断和治疗提供新的、重要的生物标志物，为甲状腺癌的治疗提供实验基础和新思路。

AKT3基因是一种与细胞周期G2期有关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能够维持细胞周期，且抑制细胞发生凋亡，从而参与多种肿瘤的发生和发展[23-24]。本研究结果显示，miR-582-5p能够降低人PTC K1细胞的活性，抑制人PTC K1细胞增殖，促进人PTC K1细胞凋亡，其机制可能与miR-582-5p调控AKT3基因表达有关。近几年来，miRNA在不同肿瘤中的作用和角色的研究已经成为热点。MiRNA 在肿瘤的发生、发展、增殖、凋亡、侵袭、转移和耐药等过程中起着十分重要的调控作用，其通过靶向作用多种癌基因或抑癌基因，在肿瘤细胞分化、血管生成、上皮间叶细胞分化、转移及耐药性等方面起一定的作用。miRNA丢失或功能调节异常均有可能导致肿瘤的发生。miRNA的作用主要通过2种方式实现：miRNA减少和miRNA替代。miRNA减少适用于在肿瘤组织中表达上调的miRNA，而miRNA适用于在肿瘤组织中表达下调或缺失的miRNA。此外，研究显示，miRNA参与了甲状腺癌的发生和发展过程，miR-144-3p能够通过靶向调控其靶基因ROCK1的表达，进而抑制PTC细胞增殖、迁移和侵袭，为临床治疗甲状腺癌提供新的靶点[23]。miR-125a-5p能够通过抑制其靶基因CD147的表达而调控甲状腺癌细胞糖代谢和肿瘤细胞的恶性程度，在甲状腺癌中发挥抑癌基因的作用，这为甲状腺癌的治疗提供了新的方法和靶点[24]。本研究观察了miR-582-5p对人PTC K1细胞增殖和凋亡的影响，而未探究其对人PTC K1细胞迁移和侵袭的影响，在后续的研究中将会继续探究miR-582-5p对人PTC K1细胞迁移和侵袭等其他生物学特征的影响。

综上所述，人PTC组织和细胞中miR-582-5p表达显著下调，miR-582-5p可能通过靶向作用于AKT3而抑制PTC细胞的增殖，促进其发生凋亡，该研究为研究PTC的发病机制及临床治疗提供新的方法和思路。