印度蔊菜(Rorippa indica)有丝分裂进程观察与核型分析

涂伟凤,张 洋,汤 洁,涂玉琴,辛佳佳,姬红利,张南峰,张 弢

(1.江西省农业科学院,江西 南昌 330200;2.江西省农业科学院 作物研究所,江西 南昌 330200;3.江西省油料作物生物学重点实验室,江西 南昌 330200;4.江西省中国科学院 庐山植物园,江西 庐山 332900)

蔊菜属于十字花科蔊菜属一年生或两年生植物[1],全草可入药,具有润肺、止咳和消炎作用[2],被广泛用于哮喘、支气管炎等呼吸道疾病治疗,其主要的有效成分为蔊菜素和蔊菜酰胺[3-4]。蔊菜对环境的适应性强,易于栽培管理,与模式植物拟南芥相比,具有发展成为新型模式植物的潜力[5-6]。由于蔊菜具有明显的抗旱、抗病[7]、耐淹[8-10]、耐贫瘠和结实结籽能力强等优良性状,其已作为栽培油菜重要的野生近缘物种,用于改良油菜的主要农艺性状[11-16]。在干旱条件下,甘蓝型油菜与蔊菜杂交后代的抗旱性明显增强[17]。然而,在蔊菜细胞遗传学方面的研究十分落后,严重限制了甘蓝型油菜与蔊菜远缘杂交育种的进程,不能够深入探讨外源遗传物质对油菜遗传改良的细胞遗传学机理以及关键功能基因的定位。所以,笔者采用常规压片和染色体分型技术,进行了蔊菜体细胞有丝分裂进程观察和中期染色体核型分析研究,以期为蔊菜的染色体组成和行为研究奠定细胞学基础,为甘蓝型油菜的远缘杂交育种和遗传改良提供细胞遗传学理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究用于蔊菜体细胞有丝分裂中期染色体观察与核型分析的子房壁组织材料,均采自江西省农业科学院蔊菜自然居群内的健康植株(见图1)。

1.2 实验方法

1.2.1 染色体制片 采用幼小雌蕊法[18],在9:00～11:00选取10株长势良好的蔊菜植株,每株分别采集3簇幼嫩花序,选取幼小花蕾,用尖头镊子剥离雌蕊并置于0.2% 8-羟基喹啉溶液中处理3 h。将处理后的雌蕊用纯水清洗3遍,然后用吸水纸吸干雌蕊表面的水分,并置于卡诺固定液(乙醇∶乙酸=3∶1)内保存。将经卡诺固定液固定24 h以上的雌蕊用纯水清洗3遍,然后置于1 mol/L HCl溶液内，以60 ℃水浴解离10 min；经常规压片、卡宝品红染色后观察染色体有丝分裂进程和中期分裂相细胞的染色体形态结构。

图1 在自然生长条件下的蔊菜植株

1.2.2 染色体核型分析 选取30张分散良好、染色体形态完整的中期分裂相细胞图像进行染色体计数,然后利用Photoshop图像处理软件进行核型分析。按照李懋学等的标准进行染色体分类和描述,根据染色体的长度比和臂比两项指标[19]进行核型不对称程度分类。另外,染色体类型、相对长度和臂比等指标参考Levan等的命名系统[20]。

2 结果与分析

2.1 蔊菜子房壁细胞有丝分裂进程

蔊菜体细胞有丝分裂进程可以分为以下5个阶段:间期、前期、中期、后期和末期。间期:间期细胞染色质浓厚,核膜、核仁结构清晰(图2a)；随着细胞发育,在核仁周围形成明显的亮环区(图2b)。前期:在细胞核内出现大量丝状染色体,呈线网状(图2c)；此后染色体进一步螺旋化,缩短变粗,核仁消失(图2d)。中期:极面观细胞内染色体形态清晰,均匀散布于细胞内,此时期染色体分散比较好的细胞可用于染色体计数和核型分析(图2e)；侧面观细胞内染色体排列在赤道板上,纺锤体结构明显,可以清晰地看出多条纺锤丝牵引染色体(图2f)。后期:所有染色体的着丝粒开始一分为二,两条染色单体逐渐分离(图2g)；随后,两组染色单体完全分开,并向细胞两极移动(图2h)。末期:两组染色单体移动至细胞两极(图2i)；细胞中央出现细胞板和明显的核仁结构,并逐渐形成两个子细胞(图2j)。

2.2 蔊菜子房壁细胞中期分裂相核型

由于蔊菜染色体数量多,体积小,所以染色体压片难度大,很难获得染色体分散比较好的中期分裂相细胞。在制片过程中,选取长势健康旺盛的蔊菜植株,剥离长度在1.5 mm左右的雌蕊可以获得中期分裂相多、染色体分散较好的细胞(见图3a)。通过雌蕊子房壁细胞有丝分裂中期染色体计数和形态观察,可以得出:蔊菜染色体数量为2n=48,即24对染色体(见图3b)。根据染色体长度的平均值绘制出蔊菜核型模式图(见图3c)。

a为蔊菜子房壁细胞有丝分裂染色体中期分裂相; b为核型图; c为核型模式图。

根据Levan等的命名系统进行蔊菜染色体形态指标分析，结果详见表1。从表1可以看出：蔊菜染色体的相对长度范围为1.51～2.82,属于小染色体类型植物；臂比范围在1.04～4.53之间,最长染色体与最短染色体比为1.87,臂比值大于2的染色体比率为0.625；蔊菜核型为2A型,属于基本对称型,核型公式为2n=48=12sm+28m+6M+2st。

表1 蔊菜有丝分裂中期染色体核型分析结果

续表1：

染色体序号染色体的相对长度/%长臂短臂全长臂比染色体类型161.100.791.891.38m170.950.871.831.09m181.191.021.811.17m190.910.871.781.04sm200.960.791.761.21m210.940.791.741.19m220.910.871.711.04M230.880.871.671.00M240.710.601.511.19m

3 讨论

染色体行为观察与核型分析是细胞遗传学研究中十分重要的工作。染色体计数、分类与形态观察是物种基因组结构解析、起源进化和功能基因定位的必要前提。由于蔊菜具有许多优异性状,已经被成功应用于近缘栽培物种油菜的遗传改良。通过蔊菜与油菜远缘杂交,可以明显提高油菜的抗旱耐湿能力。但是,蔊菜细胞遗传学研究的相对落后,严重限制了其远缘杂交后代中外源染色体(片段)鉴定和控制相关农艺性状的功能基因定位。

本研究通过幼小雌蕊法,详细地观察了蔊菜体细胞有丝分裂进程与染色体结构。根据Limade-Faria的标准[21],蔊菜属于典型的小染色体植物,即所有染色体长度均在1～4 μm范围内。与十字花科其它属植物[22-24]相比,蔊菜染色体表现出明显的数量多、长度小的特点。另外,蔊菜染色体绝对长度均在1.19～2.41 μm范围内,长度变异相对较小。所以,蔊菜染色体形态结构观察和精细分类比较困难,在今后的蔊菜细胞遗传学研究中,需要进一步发展Giemsa染色体分带技术[25]和染色体荧光原位杂交技术[26],以便快速有效地实现蔊菜染色体结构可视化与精确鉴定。在植物远缘杂交理论研究中,通过荧光原位杂交技术可以追溯杂交后代的起源、染色体组成以及不同来源染色体间的交换与互作[27-29]。