观赏向日葵腋芽组织培养及植株再生体系的研究

戚永奎, 陈 涛,朱 明, 陈建平, 沈羊城, 陈永红, 葛兆建*

(1.江苏沿海地区农业科学研究所，江苏 盐城 224002；2.盐城师范学院，江苏 盐城 224002；3.农业部 沿海盐碱地农业科学观测实验站，江苏 盐城 224002；4.盐城市呈祥园艺有限公司，江苏 盐城 224014；5.盐城昕宇农业发展有限公司，江苏 盐城 224024)

向日葵按习惯分为野生向日葵、栽培向日葵和观赏向日葵[1]。近年来，随着乡村旅游的迅猛发展，观赏向日葵越来越受到人们的青睐。而由于向日葵是异花授粉作物，在开放授粉的情况下天然异交率较高，自交结实率较低[2]，不利于种子的繁育和推广。外植体的离体培养作为一种高效的生物技术手段可以大量生产优良无性系，在向日葵新品种繁育和改良中具有巨大的应用潜力[3]，受到育种家们的重视。传统向日葵的再生途径主要通过器官[4-8]和胚胎发生而产生[9-11]，外植体的类型主要有下胚轴、子叶、子叶节和茎尖等[4]，但向日葵从转化的细胞或者组织分化再生植株困难[12]，转化频率不高，并且重复性差，是公认的难转化作物。关于利用腋芽作为外植体进行组织培养，前人在蝴蝶兰[13]、钻天柳[14]等作物上均取得了较好的效果，但在向日葵上鲜见报道。本试验主要尝试以腋芽作为外植体，研究其在观赏向日葵上的组培效果及配套技术，以期丰富向日葵组织培养外植体类型，提高再生频率，解决部分观赏向日葵品种繁殖系数低的问题。

1 材料与方法

1.1 供试品种

供试品种为YAN1339、YAN1328、YAN1569、YAN1527。其中YAN1339为黄色多头普通观赏向日葵，YAN1328为紫色多头普通观赏向日葵，YAN1569为白色多头普通观赏向日葵，YAN1527为黄色菊花型(重瓣)多头观赏向日葵。所有材料均为江苏沿海地区农业科学研究所观赏葵花课题组的自育新品系。

1.2 外植体的选择和处理

选取顶花即将开放或者已经开放的向日葵植株，采回后首先将整个植株分成几段，用洗洁净清洗干净，然后用清水冲洗0.5 h，将所有腋芽切下后，先用75%乙醇浸泡30～60 s，再用10%过氧化氢或者3%次氯酸钠溶液消毒15～20 min，然后在超净工作台上，切取腋芽5 mm大小的顶部作为外植体，接种到培养基上。

1.3 培养条件

组织培养室温度25～28 ℃，日光灯每天光照时间12 h，光照强度1600 lx，固体培养基含7.5 g/L琼脂，灭菌前调节pH值至5.8～6.0。将向日葵外植体接种于50 mL三角瓶中。外植体在培养25～30 d后直接分化出不定芽，继续培养10～15 d后继代培养1次。

1.4 数据的统计分析

试验重复3次，每个处理接种外植体15～20个，愈伤率2周后统计，不定芽诱导率6周后统计。利用SAS 9.2软件进行数据统计分析，用Duncan法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同腋芽日龄对观赏向日葵不定芽形成的影响

试验以黄色菊花型观赏向日葵YAN1527为材料，以MS+0.03 mg/L NAA+0.9 mg/L 6-BA为培养基，在腋芽开始分化时选取单株，标记腋芽的日龄，分别选取观赏向日葵顶花开放1～3 d、4～6 d、7～10 d、11～13 d、14 d以上等5种不同日龄的腋芽进行处理。结果表明：腋芽日龄越低，其组培效果越好，更容易分化出不定芽，1～3 d的腋芽不定芽诱导率最高达80.25%，而4～6 d、7～10 d、11～13 d的腋芽诱导率较之1～3 d的腋芽分别降低3.58、26.75、31.82个百分点，14 d以上的腋芽已经基本失去培养价值，诱导率仅为27.25%(图1)。由此可见，选取适龄的腋芽组培是观赏向日葵组培成功的关键，观赏向日葵最佳的外植体是1～6 d的腋芽，但是由于1～3 d的腋芽采集比较困难，实际操作时以选取4～6 d的腋芽为宜。

图1 不同腋芽日龄对观赏向日葵不定芽形成的影响

2.2 不同6-BA浓度对不同基因型观赏向日葵腋芽诱导不定芽的影响

在加入等量0.03 mg/L NAA的MS培养基中添加不同浓度的6-BA，浓度处理包括0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mg/L共6个浓度梯度，以4种供试基因型4～6 d的腋芽作为外植体材料，研究不定芽的诱导效果。结果表明：不同基因型观赏向日葵在不同浓度的6-BA培养基上培养不定芽的诱导率均呈抛物线分布，随着6-BA浓度的增加不定芽的诱导率呈先增加后下降的趋势。但是不同基因型诱导不定芽的最佳6-BA浓度略有不同，YAN1569白色多头普通观赏向日葵诱导不定芽的最佳6-BA浓度为0.6 mg/L，YAN1339黄色多头普通观赏向日葵和YAN1328紫色多头普通观赏向日葵的最佳6-BA浓度为0.6～0.9 mg/L，YAN1527黄色菊花型多头观赏向日葵诱导不定芽的最佳6-BA浓度为0.9～1.2 mg/L，普通花型多头观赏向日葵诱导不定芽需要的6-BA的浓度低于菊花型(重瓣型)观赏向日葵的，白色普通观赏向日葵不定芽的诱导率低于黄色和紫色向日葵的。不同基因型的最佳诱导率在76.5%～83.5%之间，均在80.0%左右，说明不同基因型观赏向日葵用腋芽诱导不定芽的潜力基本相同。

2.3 不同基因型观赏向日葵外植体诱导对形成愈伤组织的影响

将4种不同基因型观赏向日葵腋芽作为外植体，接种在含有上述不同浓度的所有培养基上，上述所有处理基本不形成愈伤组织或者愈伤组织很小，但是随着时间的推移，外植体在明显长大。在20～25 d后，所有处理的部分外植体上开始萌发不定芽，适中6-BA浓度处理的外植体上萌发得比较早且比例高，6-BA浓度太低和太高处理的不定芽萌发慢，同时在高浓度6-BA处理上萌发的不定芽长势较弱，甚至有停止生长的现象(图2)。而用向日葵花蕾作为外植体在组培15 d后开始形成愈伤组织，一直维持60 d左右，此后愈伤组织开始褐化而始终未能诱导出不定芽(图2)。这种在向日葵组织培养上由外植体在培养基上生长膨大，不经过愈伤阶段直接萌发成不定芽的现象未曾见到类似报道。

表1 不同6-BA浓度对不同基因型观赏向日葵腋芽诱导不定芽的影响 %

注：同列数据后的小写字母表示在0.05水平上的差异显著性，字母相同则差异不显著，不同则显著。下同。

A～D：腋芽诱导不定芽和不定根再生过程；E～F：花蕾形成愈伤组织及出现褐化现象。

3 讨论

3.1 不同腋芽日龄对观赏向日葵不定芽形成的影响

以腋芽作为外植体诱导不定芽在一些植物上有过报道，如张元国等[13]以蝴蝶兰花梗腋芽作为外植体，诱导率高达90%以上；王向军等[14]利用钻天柳腋芽进行组培，繁殖系数达到10～30倍；胡峰等[15]以厚荚相思含有腋芽的茎段进行组织培养，不定芽的诱导率最高可以达到80.56%。前人研究表明，不同日龄的组培材料是影响外植体再生能力的重要因素[16-17]。本试验以黄色菊花型(重瓣型)观赏向日葵YAN1527的不同日龄腋芽作为外植体，结果表明：低日龄腋芽诱导不定芽分化率高，其中1～3 d的腋芽不定芽诱导率最高可以达到80.25%，4～6 d的腋芽不定芽诱导率也达到76.67%，而7 d以上的腋芽分化率明显降低，14 d以上的腋芽基本失去组培价值。在实际生产中，由于1～3 d的腋芽获取相对困难，可采取4～6 d的腋芽进行观赏向日葵组培。受胡峰等[15]研究的启示，由于观赏向日葵低日龄的腋芽作为外植体的不定芽诱导率高，是否可以尝试使用含有腋芽的韧皮部作为外植体，从而提高不定芽的诱导率，有待进一步研究。

3.2 不同6-BA浓度和基因型对观赏向日葵不定芽再生的影响

关于向日葵植株再生能力与基因型之间的关系，前人研究结果存在差异。刘宝等[18]认为离体培养的再生能力与基因型间存在显著的相关性，而Pugliesi等[5]认为基因型和再生能力之间没有关系，再生能力依赖于生长调节剂之间数量上的互作。本试验以YAN1339、YAN1328、YAN1569、YAN1527等4种不同基因型的自交系为材料，以腋芽作为外植体，在加有相同量的0.03 mg/L NAA和不同浓度6-BA的MS培养基上培养，发现不同基因型最佳不定芽诱导率没有显著差异。这可能与本试验的4个材料都是由同一母本经过开放授粉后选育而成有关。但是，几种基因型诱导不定芽再生的6-BA最佳浓度不同，普通花型的观赏向日葵用腋芽作为外植体的6-BA最佳浓度为0.6～0.9 mg/L，而菊花型(重瓣型)观赏向日葵用腋芽作为外植体的最佳6-BA浓度为0.9～1.2 mg/L。

3.3 不同外植体对形成愈伤组织的影响

刘海学等[4]以子叶、子叶节、下胚轴、真叶等作为外植体在MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA的培养基上培养发现外植体平均愈伤率达到90%以上。本试验也曾用花蕾和下胚轴作为外植体，发现用花蕾和下胚轴作为外植体愈伤率达到100%，用花蕾作为外植体形成的愈伤组织呈黄绿色，愈伤块较大，但是经过60 d的培养，仍然不能诱导出不定芽，具体原因有待进一步研究。而本试验发现用腋芽作为外植体进行组织培养，基本不形成愈伤组织，或者愈伤块很小，但是在培养过程中，腋芽有明显生长增大的现象，且不定芽诱导率高。本研究表明，对于观赏向日葵利用腋芽进行组织培养，是否形成愈伤组织不是能否诱导不定芽的必要条件，而腋芽由于自身具有生长点等特定的组织结构，相对于其他外植体更容易诱导出不定芽，适合用作观赏向日葵的外植体。

4 结论

本试验以观赏向日葵作为研究载体，探讨了以腋芽作为外植体不同日龄以及不同基因型和不同6-BA浓度对不定芽诱导的影响。结果表明，低日龄的腋芽更容易诱导出不定芽，可以在不经过愈伤组织的情况下直接产生不定芽，是否形成愈伤组织不是观赏向日葵诱导出不定芽的必要条件。不同基因型间再生能力没有显著差异，但不同基因型不定芽最佳诱导率的6-BA浓度存在一定差异。在实际生产中，应选择低日龄腋芽作为外植体，根据不同基因型观赏向日葵选择适宜浓度的培养基，从而提高再生频率。