烟雾吸入后不同时间点SD大鼠肺损伤指标及氧化应激相关指标的变化趋势

程浩 宋立成 陈旭昕 奂剑波 陈丽娜 樊重阳 于丹丹 孟激光 韩志海

1安徽医科大学海军临床学院（北京 100048）；2海军总医院呼吸与危重症医学科（北京 100048）

烟雾吸入性肺损伤（smoke inhalation induced acute lung injury，SMI⁃ALI）是指热空气、蒸汽、烟雾、有害气体、挥发性化学物质等致伤因素和其中某些物质中的化学成分被人体吸入所造成的呼吸道和肺实质的损伤。若进一步发展，则可能进展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。有研究表明，火灾后单纯因烧伤而死亡的病死率低于10%，但是若合并烟雾吸入性损伤，则病死率将增至60%～80%。同时数据显示，氧化应激在烟雾吸入性肺损伤机制中起着重要作用。在烟雾吸入刺激后，机体产生过量活性氧自由基（ROS）及活性氮自由基（NOS）。消耗大量保护性还原酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等，造成机体损伤加重［1］。衔接蛋白P66Shc是新近发现的细胞氧化应激关键蛋白，由原癌基因ShcA编码，初步发现其具有调节细胞氧化应激反应和调控生命周期信号转导的作用，进来较多研究发现该蛋白在氧化应激中占据重要地位［2］；但是在烟雾吸入性肺损伤中变化趋势尚不明确。因此，本课题组于2017年11月至2018年4月通过建立大鼠烟雾吸入性肺损伤模型，观察烟雾吸入后P66Shc及相关氧化还原指标（SOD、MDA）的变化趋势，进一步明确衔接蛋白P66Shc在烟雾吸入性肺损伤中的重要作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组 50只体重为（200±10）g，8周龄健康成年雄性SD大鼠（由海军总医院实验动物中心提供。许可证号：SYXK（军）2012-0011）。随机分为5组，分别为对照组和实验组；实验组包括：烟雾吸入后1 h组、烟雾吸入后6 h组、烟雾吸入后12 h组，烟雾吸入后24 h组，每组10只。实验方案经过海军总医院动物伦理委员会批准。

1.2 实验仪器及试剂

1.2.1 实验仪器 自制产烟箱、集烟箱（产烟箱与集烟箱用管道联通，产烟箱一侧有排风扇）、产烟用电磁炉、泵吸式四合一气体检测仪（BW，型号：GASALERTMICROCLIP XT）、动脉血气分析仪（德国西门子公司）。

1.2.2 实验试剂 SOD试剂盒和MDA试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所；Anti⁃SHC抗体［EP332Y］和 Anti⁃SHC（phospho S36）抗体［6E10］均购自于英国abcam公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物模型建立 选用室内火灾中常见的易燃材料发泡橡塑绝热制品、阻尼材料、电缆线、硅丙乳胶漆等混合材料作为产烟材料。将各种产烟材料（各10 g）粉碎后充分混匀置于产烟箱中的电磁炉托盘上，封闭产烟箱，将电磁炉通电，加热维持炉丝温度300℃。待烟雾充满产烟箱后，打开排风扇将烟雾吹向集烟箱中，监测集烟箱中气体成分及浓度，利用排风扇控制集烟箱中CO：300～500 ppm，H2S：10～15 ppm，O2：20%～21.9%。将实验组SD大鼠置于集烟箱中，封闭集烟箱，稳定吸入25 min。25 min后将实验大鼠移出烟雾环境置于正常环境，观察大鼠呼吸、心率等生命体征以及精神状态，记录实验大鼠病死率。

1.3.2 实验动物处理 实验组大鼠在烟雾吸入后按各自时间点腹腔注射戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉后解剖，对照组大鼠与试验箱中吸入空气25 min直接经戊巴比妥麻醉后解剖

1.3.3 动脉血气分析 大鼠麻醉后开腹，经腹主动脉抽取动脉血1 mL，立即行动脉血气分析，检测动脉血PH、PaO2、PaCO2。

1.3.4 湿干比（W/D） 检测动脉血采集完毕后放血处死大鼠，开胸后将肺组织离体结扎左肺，完毕后分离右肺各叶，其中右肺上叶称重后置于60℃恒温箱中烘干至质量不再改变后再称重，检测其湿干比（W/D）。

1.3.5 肺组织匀浆中SOD、MDA的检测 将取出的右肺中叶研磨制成肺组织匀浆，分别依照试剂盒说明书操作检测肺组织匀浆中SOD、MDA两种氧化应激指标。

1.3.6 Western Blot方法检测肺组织匀浆中P66Shc及磷酸化P66Shc蛋白表达情况 取0.1 g肺组织与1 mL裂解液混合后研磨制成肺组织匀浆，应用BCA法检测蛋白浓度，随后按lodding buffer：肺组织匀浆液=1∶3比例制成蛋白样本，加样后于10%的丙烯酰胺凝胶分离蛋白，60 mA湿转3 h至PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭1 h，适量稀释比例的一抗P66Shc（Abcam 英国 1∶1 000）、磷酸化P66Shc（Ab⁃cam 英国 1∶1 000）、GAPDH（Cell Signaling Technol⁃ogy美国 1∶1 000），4℃孵育过夜，1×TBST洗膜3次，二抗室温孵育（Abcam 英国 1∶10 000）1 h，1×TBST洗膜3次，ECL化学显影，运用Image J软件对Western Blot结果行半定量灰度值分析。

1.3.7 肺组织病理观察 将取出的右肺下叶迅速放入4%多聚甲醛溶液中固定，24 h后进行石蜡包埋，HE染色，光镜下观察肺组织病理学改变。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行统计分析，PH、PaO2、PaCO2、SOD、MDA等计量资料均采用均数±标准差表示。若方差齐，多组间计量资料采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA），组间比较采用LSD检验。若方差不齐，组间则采用Dunnett T3检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验大鼠精神状态及病死率 烟雾吸入后1 h内，可见实验大鼠出现呼吸深快，心率明显增快，并且口鼻部满布黑色烟雾颗粒。其中7只大鼠出现烦躁不安，12只大鼠精神萎靡；其余大鼠精神状态一般。其中在移出烟雾环境后1 min～1 h内病死率2.5%（1/40）；1～6 h内病死率6.7%（2/30）；6～12 h内死亡率15%（3/20）；12～24 h内病死率11%（1/9），对照组10只无死亡。

2.2 血气分析结果 烟雾吸入后，动脉血PaO2明显下降（P＜0.001），其中在吸入后1 h降至最低，随后，PaO2逐渐恢复。PH值在烟雾吸入后与对照组相比，在1、24 h组差异有统计学意义（P＜0.05）。而在吸入后6 h组及12 h组与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。PaCO2仅在烟雾吸入后1 h组与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），在吸入后6、12、24 h组均差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠动脉血气分析结果Tab.1 Arterial blood gas analysis results in each group of rats x±s

2.3 湿干比（W/D）结果 烟雾吸入后，大鼠肺组织湿质量与干质量比值（W/D）明显升高；烟雾吸入后1、6、12以及24 h组与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。其中在烟雾吸入1 h后W/D值达到最高，后随着时间进展，有所下降，在烟雾吸入后6、12和24 h之间，肺组织W/D值差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 MDA、SOD结果 烟雾吸入后，大鼠肺组织匀浆中MDA明显上升（P＜0.05）。与对照组相比烟雾吸入后1、6、12 h MDA浓度逐渐增高，差异有统计学意义（P＞0.05）。在吸入后24 h时，MDA浓度有所下降。但仍然高于对照组。烟雾吸入后，大鼠肺组织匀浆中SOD活力明显下降（P＜0.05）。与对照组相比，烟雾吸入后1、6、12、24 h SOD活力均有所下降，其中在吸入后12 h组，SOD活力降至最低。吸入后12 h组与吸入后24 h组相比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同组别大鼠肺组织W/D、SOD及MDA结果Tab.2 Lung tissue W/D，SOD and MDA results in each group x±s

2.5 衔接蛋白P66Shc及磷酸化P66Shc表达情况 Western blot结果显示，与对照组相比，烟雾吸入后衔接蛋白P66Shc以及磷酸化P66Shc的表达量明显上升，其中以吸入后12 h和24 h表达量最多。见图1。Image J灰度值分析结果如图2，与对照组相比，烟雾吸入后，磷酸化P66Shc与P66shc比值有所上升，在烟雾吸入后12 h组，磷酸化P66Shc所占比例最高（2.95±0.16），与对照组（1.10±0.05）相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 各组大鼠肺组织P66Shc以及P⁃P66Shc蛋白表达情况Fig.1 The expression of P66Shc and P⁃P66Shc protein in lung tissue of rats in each group

图2 各组P⁃P66Shc/P66Shc灰度值比值结果Fig.2 P⁃P66Shc/P66Shc grayscale valueratio results for each group

2.6 肺组织病理 对照组大鼠右肺下叶肺泡结构完整，烟雾吸入后不同时间点肺泡结构均有不同程度损伤，肺泡间隔与肺泡腔有炎性细胞浸润并伴有粉红色渗出物。其中烟雾吸入后12 h组，肺泡壁增厚，肺泡结构破坏最为严重。见图3。

3 讨论

目前，有相关研究表明，火灾中致人死亡的首要原因是烟雾吸入［3］。其中，氧化应激在烟雾吸入性肺损伤中也占据着主导作用。烟雾吸入后，机体通过NF⁃κB等信号通路使肺组织ROS表达急剧增加［4］，过多的ROS一方面可与肺组织细胞膜结合发生过氧化反应，最终形成对细胞有毒害作用的过氧化产物MDA［5］，因此MDA可作为机体氧化应激强度大小的指标。另一方面，ROS的急剧增加会大量消耗体内抗氧化酶SOD，使得机体肺组织SOD活性急剧下降。SOD活性下降，机体无法及时清除自身所产生的ROS，进一步加重氧化应激损伤［6］。P66Shc是一种具有调节氧化应激功能的蛋白，目前研究认为，P66Shc调节细胞内ROS的水平主要通过两种方式，一是直接增加细胞内ROS的产生；二是减弱细胞对ROS的清除能力。正常情况下，P66Shc处于失活状态，主要定位于细胞胞浆，小部分（10%～40%）与线粒体热休克蛋白70结合，存在于线粒体膜间隙［2］。在氧化应激诱导剂刺激下，使细胞内的P66Shc表达升高，同时激活蛋白激酶C（PKCβ）、p53等引起P66Shc磷酸化，而被脯氨酰异构酶（Pin1）识别发生构象改变，并在蛋白磷酸酶2A（PP2A）的作用下发生去磷酸化，并转移至线粒体中；同时刺激使线粒体P66Shc单体从复合体中释放出来，与转移至线粒体中的P66Shc共同发挥氧化还原酶的活性。在线粒体呼吸中，电子从复合体Ⅰ、复合体Ⅱ传递至辅酶Q再传递至复合体Ⅲ，通过细胞色素C传递至复合体Ⅳ生成水，而单体化的P66Shc则氧化细胞色素C，使电子不能顺利传递至复合体Ⅳ形成H2O，而是形成ROS（H2O2），ROS 水平升高引起细胞氧化损伤，并导致线粒体渗透性孔道通透性改变。此外，磷酸化的P66Shc抑制AKT依赖的叉头转录因子FOXO3a，即FKHRL⁃1，使SOD生成减少，细胞对ROS的清除能力下降［7-9］。因此，本研究以动脉血气分析（PaO2、PaCO2、PH）、肺组织湿干比（W/D）、以及光镜下肺组织病理学特点为指标对烟雾吸入性肺损伤模型进行评价。以SOD、MDA活性大小以及衔接蛋白P66Shc表达量多少反映烟雾吸入后机体氧化应激程度的大小。

本实验发现烟雾吸入后PaO2迅速下降，在吸入后1 h组达到最低值并小于60 mmHg，若FiO2按21%计算，则此时PaO2/FiO2＜300，符合最新关于ARDS诊断标准的轻度ARDS。在随后的时间点内PaO2逐渐上升，因此，在烟雾吸入1 h内，最重要损伤因素为急性缺氧。此结果与其他烟雾损伤模型类似［10］。并且，本实验发现烟雾吸入后，大鼠肺组织W/D明显上升，在吸入后1 h组达到最高值，此后有所降低，但仍未恢复至对照组水平，可能原因为烟雾吸入后1 h内急性缺氧严重，加快大鼠呼吸频率，并且由于烟雾刺激，肺组织渗出急剧增多，而在后续时间内，大鼠缺氧状态逐渐缓解，同时脱离了烟雾刺激，渗出逐渐减少。观察本实验肺病理切片，可见烟雾吸入后，光镜下表现为肺泡壁间隔增厚，炎性细胞浸润并伴有粉红色渗出物，尤以吸入后12 h组表现最为严重，部分肺泡间隔断裂，肺泡可见明显出血。

本实验发现，烟雾吸入后，肺组织匀浆中MDA浓度随着时间进展逐渐上升，在吸入后12 h组达到最高峰，随后MDA浓度开始下降，至吸入后24 h组，仍明显高于对照组。SOD活力在烟雾吸入后逐渐降低，在吸入后12 h组降至最低。该结果说明烟雾吸入后，实验大鼠氧化应激加强，机体随之需消耗大量清除ROS的活性酶，造成抗氧化能力下降。并且，在烟雾吸入后12～24 h内为机体氧化应激最为严重时段。

研究证实P66Shc在肺泡上皮细胞系中存在表达，且PKCβ/P66Shc信号通路介导了高氧诱导的人肺泡上皮细胞凋亡［11］。研究证实P66Shc基因缺失小鼠成纤维细胞受到紫外线、无血清及过氧化氢刺激后细胞内ROS水平较野生型成纤维细胞显著下降，而过表达P66Shc基因的成纤维细胞对氧化应激的反应性则明显增强。P66Shc基因缺失的内皮细胞、淋巴细胞，其细胞内的ROS水平和DNA的氧化损伤明显降低，而将P66Shc全长基因转染至不表达P66Shc的细胞中，其对于氧化应激敏感性增强［12-13］。本实验显示，烟雾吸入后大鼠肺组织P66Shc及磷酸化P66Shc蛋白表达量远高于正常对照组，并在吸入后12和24 h组表达增加最为显著，烟雾吸入后磷酸化P66Shc蛋白与P66Shc比值增加，在烟雾吸入后12 h组达到最高峰，此结果表明衔接蛋白P66shc在烟雾吸入后磷酸化增多，活化增多，进一步说明烟雾吸入后氧化应激加强并在吸入后12 h氧化应激最强。既往研究显示P66Shc的表达增多会激活PKC/P66Shc信号通路进而消耗更多的SOD［14］。本实验结果发现当衔接蛋白P66Shc磷酸化活化达到最高峰时SOD活力则降至最低。可能是因为P66Shc激活了PKC/P66Shc信号通路，因此消耗了更多的SOD，加重机体氧化应激损伤。

综上所述，烟雾吸入后，机体尤其是肺组织氧化应激明显增强，表现为MDA的明显上升、SOD的明显下降、P66Shc的表达增加以及该蛋白磷酸化增强。并且在吸入后12 h以及24 h氧化应激达到高峰。