匀浆法提取沙枣果总黄酮工艺研究

张圆圆 孟永斌 徐 蕾 贾 楠 孟庆焕 项凤影 路 祺

(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

沙枣又称七里香、香柳等(ElaeagnusangustifoliaL.)为胡颓子科(Elaeagnaceae)胡颓子属(Elaeagnus)落叶乔木或小乔木。在国内集中分布于西北部的各个省区以及内蒙古的西部地区，大致分布在北纬34°以北。天然的沙枣林密集分布在玛纳斯河、甘肃疏勒河、新疆塔里木河、内蒙古的额济纳河两岸。沙枣浑身是宝，花可提芳香油或调香原料，树液能提沙枣胶，木材细致坚韧，可以做家具、农具，沙枣根蘖性比较强，能够保持水土，抵抗风沙，改善土壤，调节气侯等，用于防护林、用材林和风景林等。沙枣果肉含有多糖、黄酮、蛋白质和维生素等营养成分，可生食或熟食，有些地区甚至将果肉打粉，然后掺在面粉内代替主食，还可以用来酿酒和醋，或做果酱、糕点等食材[1]。沙枣黄酮可用于治疗烧伤、肠炎腹泻、脾胃虚弱、支气管炎等，沙枣在新疆作为维吾尔药(称“吉嘎旦”)在民间已经有悠久历史[2]。

黄酮类化合物，也称类黄酮[3]，是以黄酮(2-苯基色原酮)为母核而衍生的一类黄色色素。在植物体内，有两种存在形式，大多数与糖结合成苷类或碳糖基的结合态存在。由于其分子结构中含未共用的孤对电子，又表现出碱性，所以可以和无机酸生成盐，但是不稳定，遇水之后迅速分解[4]。黄酮类化合物的主要生理活性有[5～8]：(1)心血管系统活性；(2)抗菌及抗病毒活性；(3)抗肿瘤活性；(4)抗氧化自由基活性；(5)抗炎、镇痛活性；(6)保肝活性；(7)其他功能，除上述功能外，黄酮类物质还对平滑肌的解痉，支气管的松弛、机体免疫力提高等有一定作用。

匀浆提取是指组织通过加入萃取溶剂进行组织匀浆或磨浆，以提取组织中有效成分的一种提取方法。此方法不但缩短了提取时间，而且提取效率高、操作步骤简便。近年来广泛应用于中草药有效成分的提取和食品加工等领域，效果良好[9]，如匀浆法提取虎杖中虎杖苷和白藜芦醇[10]、匀浆法提取石斛中多糖[11]、匀浆提取刺五加主要酚苷及苷元[12]、匀浆提取银杏叶原花青素工艺等[13]。本研采用匀浆法提取沙枣果总黄酮，通过单因素实验和正交实验优化沙枣果总黄酮提取工艺条件，通过本研究将为沙枣果的开发利用提供理论依据，也为沙枣果保健品的开发提供数据支持。

1 实验材料与仪器

1.1 实验材料

沙枣果由阿拉善盟悦禾科技生态有限责任公司提供；氢氧化钠、亚硝酸钠、无水乙醇、硝酸铝均为分析纯，购于科密欧化学试剂厂；芦丁(标准品)购于Sigma公司。

1.2 实验仪器

HL-60型烘箱，购于上海跃进医疗器械有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪，DK-98-I型水浴锅，购于泰特化工设备有限公司；匀浆萃取装置，购于飞利浦公司；3K-30型离心机，购于Sigma公司；美国Nicolet公司的MAGNA-IR560 E.S.P型红外光谱仪；BS124S电子天平，购于北京赛多利斯有限公司。

2 实验方法

2.1 样品准备和总黄酮的提取

沙枣果冻干后，进行果肉与种子分离，得沙枣果肉。

匀浆法基础实验条件为：取沙枣果10 g，按比例加入一定浓度的乙醇溶液，室温下匀浆提取，反应结束后立即3 000 r·min-1离心10 min，倒出上清液检测黄酮得率。在其它实验条件固定情况下，分别探讨乙醇浓度、料液比、反应时间、反应次数，4个因素对匀浆法沙枣果总黄酮得率的影响，并通过正交实验优化沙枣果总黄酮提取工艺条件。

2.2 总黄酮检测方法

总黄酮检测方法如下：取0.5 mL稀释一定倍数后样品置于比色管中，依次分别加入0.5 mL 5%(w/v)亚硝酸钠，0.5 mL 10%(w/v)硝酸铝，4.0 mL 4%氢氧化钠和4.5 mL 95%乙醇，混匀以后，避光静止15 min，510 nm波长下检定吸光值。以芦丁为标准品制作标准曲线，5 mg芦丁标准品加5 mL甲醇溶解。配置浓度1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg·mL-1的标准溶液，空白样品是以蒸馏水代替样品。通过标准曲线计算黄酮浓度，从而计算黄酮得率，公式如下：

(1)

式中：y代表总黄酮得率(%)；c表示样品浓度(mg·mL-1)；v表示测定时提取液总体积(mL)；m表示样品质量(mg)[14～19]。

2.3 红外光谱分析

将2.0 mg试样与200 mg溴化钾(KBr)混匀，经玛瑙研钵研磨后压片，采用美国Nicolet公司的MAGNA-IR560 E.S.P型红外光谱仪(扫描范围4 000～400 cm-1)进行红外光谱测定[20]。

2.4 扫描电镜分析

利用扫描电镜进行微观形貌观察，所采用的仪器为MX2600FE型环境扫描电子显微镜。用导电胶将烘干、粉碎过80目筛的样品固定在样品平台上，喷金，用扫描电子显微镜观察样品的表面形态。

3 结果与分析

3.1 单因素实验部分

3.1.1 乙醇浓度对沙枣果总黄酮提取的影响

匀浆法实验条件为：在料液比1∶20 g·mL-1、匀浆提取时间3 min、室温不变的条件下，分别选取40%、55%、70%、85%、100%，5个乙醇浓度，探讨乙醇浓度对匀浆法提取沙枣果总黄酮的影响；传统水浴法实验条件为：在料液比1∶20 g·mL-1、提取温度70℃、提取时间30 min不变的条件下，探讨乙醇浓度对传统水浴提取沙枣果总黄酮的影响。

当乙醇浓度低于55%时，随着乙醇浓度的逐渐增加沙枣果总黄酮得率也随之逐渐增加；当乙醇浓度等于55%时，沙枣果总黄酮得率最高；当乙醇浓度高于55%时，随着乙醇浓度的增加沙枣果总黄酮得率逐渐降低(图1)。这是因为在一定的范围内，随着乙醇浓度的增加，沙枣果总黄酮类化合物的溶解度逐渐升高；当乙醇浓度超一定范围时，导致细胞内的蛋白凝固，黄酮则不易溶出，所以选择55%乙醇作为匀浆法提取沙枣果总黄酮最佳浓度。

图1 乙醇浓度对沙枣果总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on Elaeagnus angustifolia fruit flavonoids extraction

在图1中也可以看出，传统的水浴提取方法在乙醇浓度相同的情况下，总黄酮的得率均远远低于其匀浆法。因此在乙醇浓度相同的情况下，匀浆法更适合提取总黄酮。

3.1.2 料液比对沙枣果总黄酮提取的影响

匀浆法实验条件为：在55%乙醇浓度、匀浆提取时间3 min、室温不变条件下，探讨料液比对匀浆提取沙枣果总黄酮的影响，分别选取以下几个料液比，1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g·mL-1；传统水浴法实验条件为：在70%乙醇浓度、提取温度70℃、提取时间30 min不变的条件下，探讨料液比对传统水浴提取沙枣果总黄酮的影响。

由图2可知，当料液比小于1∶30 g·mL-1时，随着料液比的逐渐增加沙枣果总黄酮得率也跟着逐渐增加；当料液比等于1∶30 g·mL-1时，沙枣果总黄酮得率最高；当料液比大于1∶30 g·mL-1时，随着料液比的增加沙枣果总黄酮得率逐渐趋于稳定。这是因为在一定的范围内，随着料液比的不断增加，反应溶剂所占比例逐渐增加，使得沙枣果粉与提取溶剂的接触率大大增加，导致沙枣果总黄酮类化合物的溶解量逐渐增加；而当料液比超出一定范围时，沙枣果中黄酮类化合物提取较为充分，而继续增加料液比，沙枣果总黄酮类化合物的得率趋于稳定。所以选择1∶30 g·mL-1作为匀浆提取沙枣果总黄酮最佳料液比。

图2 料液比对沙枣果总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of the ratio of material to liquid on E.angustifolia fruit flavonoids extraction

虽然在传统的水浴提取方法，总黄酮的得率随着料液比的增大而增加，但是其增加幅度远低于同样条件下匀浆法提取的总黄酮得率。因此在料液比相同的情况下选择匀浆法提取总黄酮更为经济实用。

3.1.3 匀浆提取时间对沙枣果总黄酮提取的影响

匀浆法实验条件为：在料液比1∶30 g·mL-1、提取温度室温、55%乙醇不变的情况下，分别选取以下几个提取时间1、3、5、7、9 min，来探讨提取时间对沙枣果总黄酮得率的影响；传统水浴法实验条件为：在料液比1∶30 g·mL-1、70%乙醇浓度、提取温度70℃不变的条件下，探讨提取时间对传统水浴提取沙枣果总黄酮的影响。

图3 匀浆提取时间对沙枣果总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of time on E.angustifolia fruit flavonoids extraction

由图3可知，随着匀浆时间的延长，沙枣果总黄酮得率逐渐增加；当匀浆时间等于5 min时，沙枣果总黄酮得率最高；当匀浆时间大于5 min时，随着匀浆提取的进一步延长，沙枣果总黄酮得率基本趋于稳定。这是因为充足的匀浆时间有利于沙枣果总黄酮的溶解与溶出，随着匀浆提取时间进一步延长，沙枣果总黄酮得率逐渐增加，但过长的匀浆时间，提取物中杂质物质不断溶出，阻碍黄酮类化合物溶出，导致黄酮得率也不会明显增加。因此，匀浆法提取沙枣果总黄酮的适宜提取时间为5 min。

传统的水浴提取方法黄酮得率先随着水浴时间的延长而增加，后趋于平稳，其得率最高为4.43%。可以明显看出匀浆法提取总黄酮时，不仅表现在时间上大大缩短，而且得率也远高于传统水浴提取方法。

3.1.4 匀浆提取次数对沙枣果总黄酮提取的影响

匀浆法实验条件为：在料液比1∶30 g·mL-1、提取温度室温、乙醇浓度55%、提取时间为5 min不变的情况下，来探讨提取次数对沙枣果总黄酮提取的影响，分别选取以下几个提取次数，即1、2、3、4、5、6次；传统水浴法实验条件为：在料液比1∶30 g·mL-1、70%乙醇浓度、提取温度70℃、提取时间30 min不变的条件下，探讨提取次数对传统水浴提取沙枣果总黄酮的影响。

由图4可知，随着提取次数的不断增加，沙枣果总黄酮得率不断降低，当提取次数超过3次时，沙枣果总黄酮总得率随着提取次数继续增加，基本保持恒定。匀浆法第一次提取沙枣果总黄酮占沙枣果总黄酮的63.48%，第二次提取沙枣果总黄酮占沙枣果总黄酮15.89%，前两次提取的沙枣果总黄酮占沙枣果总黄酮的80%左右，即匀浆法提取二次后，沙枣果总黄酮已经基本提取充分，考虑到后期溶剂回收成本等问题，确定匀浆法提取沙枣果总黄酮的适宜提取次数为2次。

图4 提取次数对沙枣果总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of extraction times on E.angustifolia fruit flavonoids extraction

传统的水浴提取方法与匀浆法相比，匀浆法得率高于水浴法，匀浆法提取总黄酮更完全一些。优于传统水浴法，即不需要太多的提取次数便可达到高的提取率。

综上所述，匀浆法提取沙枣果总黄酮不仅减少了乙醇的用量，缩短了提取时间，降低料液比，减少了提取次数，而且提取总黄酮得率也远高于传统水浴提取法。因此，匀浆法是更适合于沙枣果总黄酮的提取方法。

3.2 正交实验部分

通过前面单因素实验确定采用匀浆法提取沙枣果总黄酮，以沙枣果总黄酮得率为匀浆法提取沙枣果总黄酮能评价指标，对乙醇浓度、匀浆时间和料液比进行L9(3)4正交实验设计，探讨并优化匀浆法提取工艺条件(表1～2)。

表1 L9(3)4正交实验因素和水平Table 1 The factors and levels of the orthogonal array design L9(3)4

通过直观分析，根据R值，可知最优实验条件为：A2B3C2，即乙醇浓度55%，匀浆料液比1∶30 g·mL-1，匀浆时间5 min。从各因素极差值可知，A>B>C，对匀浆法沙枣果总黄酮得率影响的主次顺序为：乙醇浓度>匀浆时间>匀浆料液比。

表2 L9(3)4正交实验结果Table 2 Orthogonal array design L9(3)4 and experimental results

匀浆法提取沙枣果总黄酮的方差分析数据见表3。

查表有F0.01(2,2)=99.00；F0.05(2,2)=19.00；F0.1(2,2)=9.00。

当F>F0.01，有高度显著影响；当F0.01>F>F0.05，有显著影响；当F0.05>F>F0.1时，有一定的影响；当F

计算结果表明，因素A的FA，为F0.05>FA>F0.1；因素B的FB，为FB

表3 匀浆法沙枣果总黄酮得率方差分析Table 3 The variance analysis of E.angustifolia fruit flavonoid yield with homogenization

通过正交实验得到匀浆法提取沙枣果总黄酮的优化工艺条件：乙醇浓度55%，匀浆料液比1∶30 g·mL-1，匀浆时间5 min，提取次数2次，重复性验证实验结果表明得率稳定，重复性较好，沙枣果总黄酮总得率为6.57%。综上所述，匀浆法相较于水浴法，操作更加简便、快捷，作用效果更强，得率更高，所以沙枣果的提取选择匀浆法更佳，本研究对匀浆法提取的沙枣果总黄酮提取物及剩余物进行进一步结构表征。

3.3 红外光谱分析

图5 沙枣果匀浆提取物红外光谱图Fig.5 FTIR of the extraction of E.angustifolia fruit with homogenate method

3.4 扫描电镜分析

图6分别是沙枣果原料、沙枣果匀浆提取剩余物的SEM图片。可以明显看出沙枣果渣(A)表面相对光滑没有明显裂痕，表面有淀粉粒存在。经过匀浆处理的沙枣果渣提取剩余物(B)表面有小裂痕和组织缝隙，并且表面的淀粉粒也大量消失，这说明匀浆处理对沙枣果的组织结构影响较大，其原因是匀浆将样品进行机械粉碎，导致沙枣果的组织结构被破坏，大大增加了乙醇与提取物的接触面积[21～23]。

图6 沙枣果原原料(A)、沙枣果匀浆提取剩余物(B)的扫描电镜图Fig.6 SEM of E.angustifolia fruit pomace(A) and the extraction residues of E.angustifolia fruit with homogenate method(B)

4 结论

通过传统水浴提取法和匀浆提取法单因素对比实验，可以明显看出匀浆法提取沙枣果总黄酮具有乙醇用量少，提取时间短，提取次数少等优点，总黄酮得率也远高于传统水浴提取法。通过L9(3)4正交实验设计，优化匀浆法提取工艺条件，其最优工艺为：乙醇浓度55%，匀浆料液比1∶30 g·mL-1，匀浆时间5 min，室温，匀浆提取次数2次，匀浆提取沙枣果黄酮类化合物的最大得率为6.57%。从实验结果可以看出匀浆法提取沙枣果黄酮得率高，操作更加简便、快捷。本研究对匀浆法提取的沙枣果黄酮提取物及剩余物进行结构表征。通过对提取物进行红外表征可以看出，匀浆法提取的沙枣果提取物中含有黄酮类化合物的特征峰；通过对剩余物进行SEM结构表征可以看出，匀浆法对样品的机械作用强烈。