肺抑瘤膏对EGFR野生型Lewis肺癌小鼠肿瘤生长及VEGF表达的影响

彭召云 郑 心 孟宪志 李新昌 鲁兴隆 李龙祥

(山东中医药大学第二附属医院，山东 济南 250001)

原发性支气管肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其中，肺腺癌约占肺癌发病率的25%〔1〕，确诊时绝大多数已属中晚期，且化疗耐药、放疗抵抗、分子靶向治疗耐药等问题的存在〔2,3〕，应用单一治疗方法难以获得满意疗效，表皮生长因子受体(EGFR)非基因突变型肺腺癌靶向治疗效果差〔4〕，因此，积极寻找有效的抗EGFR非基因突变型肺腺癌的新方法成为当前研究的热点、难点。本实验通过观察肺抑瘤膏干预EGFR非基因突变型小鼠肺腺癌移植瘤模型，探讨抑制EGFR非基因突变型肺腺癌发生发展的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 C57BL/6近交系雄性小鼠(动物合格证号SCXK(京)2009-0004)，6～8周龄，体重(18±2)g。接种了Lewis鼠源肺腺癌细胞株的小鼠购于山东省医学科学院。于SPF级动物房自由饮水摄食饲养，温度20～24℃，相对湿度50%～60%。通风良好条件下，常规饲养至适应环境后，进行造模。

1.2主要实验试剂及药物 Taq DNA聚合酶、DNA分子量Marker(宝生物公司产品)，测序试剂：ABI BigDye3.1。二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶配制试剂盒、SDS-PAGE电泳液、预染Marker、内参、内参二抗、血管内皮生长因子(VEGF)抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、聚偏氟乙烯(PVDF)膜等(碧云天)。0.9%氯化钠注射液(中国大冢制药有限公司)，肺抑瘤膏(每毫升膏方含生药量约4.3 g)由山东中医药大学第二附属医院药剂科提供。

1.3造模方法 颈椎脱臼法处死肿瘤生长良好的Lewis肺腺癌荷瘤小鼠，在超净工作台上用无菌剪刀、镊子完整剥离肿瘤组织，于冰上研磨并制备细胞悬浊液，离心计数后调整细胞浓度为1.0×107/ml，在小鼠腋窝下接种肿瘤细胞悬液0.2 ml/只(约含瘤细胞2.0×106个)。

1.4分组及给药 接种肿瘤细胞后，每日观察小鼠腋下移植瘤生长情况，当能用游标卡尺测到瘤体时，按照SPSS统计软件随机设立生理盐水对照组、肺抑瘤膏干预组，每组10只。分组后开始灌胃。对照组每天予生理盐水灌胃0.2 ml/次。干预组每天予肺抑瘤膏灌胃0.2 ml/次(相当于70 kg成人按体表面积折算的等效剂量)。

1.5EGFR基因测序 引物序列：fw-18：TCAGGTCTGCTCCCTTCTTC，rs-18：CAGCTACATTCCCAGTCTAC GT。fw-19：TTGGATTTGTAATGTAGAGCCC，rs-19：AACTAAGGAAGCAAGATTGACC。fw-20：AGTCTTGCA TAACCTGACACTTG，rs-20：TCATCCTTGCTGCTTTTC TT。fw-21：AGGATGCCCAGATGGTTCA，rs-21：GCTGGTCTTTTGAGGGGTG。PCR 扩增:① PCR 反应体系(50 μl)：10×PCR缓冲液5 μl，dNTP(10 μmol/L)1 μl，primer-fw(10 μmol/L)2 μl，primer-rs(10 μmol/L)2 μl，Template 2 μl，二甲基亚砜(DMSO)1.5 μl，ddH2O 37.5 μl。②PCR 反应条件:95℃ 5 min 1个循环，95℃ 30 s 35个循环，50℃ 30 s 35个循环，72℃ 30 s 35个循环，72℃ 10 min 1个循环。

1.6观察指标及方法 (1)瘤体体积：剥离瘤体后用精度为0.01 mm游标卡尺测量瘤体最长径、最短径，计算瘤体体积。瘤体体积(mm3)=π×最长径×最短径2/6。(2)瘤重、抑瘤率及移植瘤生长指数：末次灌胃24 h后称重处死存活小鼠，剥离瘤体，称瘤重，计算各组肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=(对照组平均瘤重-干预组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。移植瘤生长指数=移植瘤重量/去除肿瘤后的小鼠体重。(3)VEGF检测：免疫印迹法检测移植瘤中VEGF蛋白表达以及β-actin灰度比值比较。(4)EGFR检测：小鼠移植瘤EGFR基因(18、19、20、21 号外显子)毛细管电泳测序。

1.7统计学方法 采用 SPSS17.0统计软件进行方差分析。

2 结 果

2.1一般情况 随移植瘤的生长，两组小鼠活动均减少，攻击性降低，精神萎靡，进食、饮水减少，毛发无光泽易脱落，对照组表现较干预组明显。

2.2种植成功率 接种Lewis细胞后1 w内所有小鼠腋下可触及移植瘤，瘤体体积均可达100～150 mm3，成瘤率100%。

2.3瘤体体积 小鼠移植瘤种植第10天后，肿瘤体积迅速增长，可见明显“拐点”。两组小鼠可明显看出肺抑瘤膏干预后，小鼠移植瘤体积增长明显减缓，最后一次瘤体体积差异有统计学意义(P=0.028)，见图1。

图1 瘤体体积增长曲线

2.4两组瘤重、抑瘤率、移植瘤生长指数比较 干预组瘤重、生长指数明显低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组移植瘤瘤重、抑瘤率、生长指数比较

与对照组比较：1)P=0.00，2)P=0.013

2.5VEGF检测结果 干预组移植瘤VEGF表达(0.055 5±0.012 1)低于对照组(0.110 1±0.015 6)，差异有统计学意义(P=0.00)，见图2。

图2 VEGF蛋白的Western印迹结果

2.6EGFR基因毛细管电泳测序结果 18、19、20、21 号外显子均测序合格。其中20 号外显子含polyA和polyG结果，已经进行加测反应；比对结果显示无明显突变，见图3、4。

图3 样品基因组DNA电泳图

图4 PCR扩增产物电泳图

3 讨 论

肺癌居全球癌症首位〔5〕，且发病率和死亡率还在不断增长〔6〕。现代医学对于肺癌缺乏有效的治疗方法，放化疗有诸多的不良反应及局限性，EGFR非基因突变型肺腺癌靶向治疗效果不佳。目前临床迫切需要安全、有效的综合治疗方案。近年来临床研究表明中医药在提高肺癌患者生活质量、显著缓解病痛、延长生存期限、稳定肿瘤病灶等方面有着不可替换的优势〔7～9〕。在肿瘤防治方面的应用日趋被接受并得到重视，中药抗EGFR非基因突变型肺腺癌的研究有重要临床意义。

中医膏方中以党参、黄芪为君补益肺脾之气；白术祛湿助脾气健运、茯苓渗湿健脾、麦冬养阴生津润肺清心、女贞子滋补肝肾共为臣药。佐以浙贝、夏枯草、山慈菇清热散结，薏苡仁渗湿健脾，贯众清热凉血，莪术破血行气、消积止痛，蜂房攻毒破积。生甘草清热解毒，调和诸药为使。本方诸药合用，组方严谨，扶正而不敛邪，祛邪而不伤正，气血同治，寒热平调，平补阴阳，无耗气伤阴之弊。整体体现了扶正祛邪、动静结合、攻补兼施的配伍特点。前期临床研究发现晚期肺癌患者应用肺抑瘤膏，可有效控制原发肿瘤病灶，减轻化疗引起的毒副反应，提高患者的生存质量，延长患者生存期〔8～11〕。且膏剂有口感好、剂型小、服用量少、便于携带、易于耐受等优点，充分体现了中药简、便、廉、验的特点。前期动物实验从抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、提高机体免疫功能等多环节入手进行了一系列研究〔8～13〕，但对EGFR非基因突变型肺腺癌的实验研究尚属首次。

本实验通过EGFR基因测序，证实Lewis肺腺癌EGFR基因为非基因突变型。本实验结果提示肺抑瘤膏对EGFR非基因突变型肺腺癌移植瘤原发病灶有明显的抑制作用，能有效抑制其瘤体生长，降低移植瘤的生长率，且能降低VEGF表达。研究表明〔7〕VEGF有强烈加速血管上皮细胞的分化作用，从而诱导新血管生成，肿瘤的生长、转移及转移部位的生长与血管新生密切相关。降低VEGF的表达可减少肿瘤新生血管的增生，最终抑制肿瘤的进展。故推断肺抑瘤膏治疗EGFR非基因突变型肺腺癌是通过抑制VEGF的表达从而起到抑制肿瘤的目的。为寻找新的抗EGFR非基因突变型肺腺癌药物提供了思路。