miR-218对血管紧张素II诱导的心肌细胞肥大的影响

王译晗 朱海英 骆海燕 陆彩玲 高小博∗

1.国家卫生计生委科学技术研究所(北京,100081);2.北京协和医学院研究生院

先天性心脏病是最常见的出生缺陷类型,其伴随的血流动力学改变最终会导致心肌肥厚的发生[1-2]。心肌肥厚是心脏应对心衰的适应性反应,长期压力超负荷导致心肌代偿性肥厚,进而发展为失代偿,最终导致心衰甚至猝死[3-4]。miR-218是一个高度保守的微小RNA(miRNA)。研究报道miR-218通过负调节Robo受体调控斑马鱼心管发育,敲低miR-218会降低心内膜细胞和心肌细胞的迁移率,引起心包水肿和心脏形态异常[5]。Chiavacci等[6]报道miR-218敲低能援救Tbx5过表达所致的心脏发育缺陷。Liu等[7]发现miR-218能抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大。但miR-218在血管紧张素II(Ang II)诱导的心肌肥厚中的作用及机制仍不清楚,为此我们研究了miR-218对Ang II诱导心肌细胞肥大的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂与设备

Anti-Ankrd1抗体购自美国Proteintech公司,Anti-α-actinin和 Anti-β-actin抗体、TRITC标记的抗小鼠IgG荧光二抗、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、5-溴脱氧尿嘧啶(5-Brd U)和Ang II均购自美国Sigma-Aldrich公司,辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗兔IgG二抗和山羊抗小鼠IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司,mimic miR-218和inhibitor miR-218及对照,心房利钠肽(ANF),Ankrd1,GAPDH,miR-218及U6引物均合成于上海生工生物工程股份有限公司,高效组织细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司),二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、反转录试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司),双荧光素酶报告基因试剂盒(美国Promega公司),增强化学发光(ECL)液(美国 Merck Millipore公司),RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司),DMEM/F12液体培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司),胰酶细胞消化液(上海碧云天生物技术有限公司)。CO2恒温细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司),激光共聚焦显微镜(Zeiss,LSM 710,德国),全自动酶标仪(Bio Tek,Gen5),实时荧光定量PCR系统(ABI Prism 7500,美国)。

1.2 原代心肌细胞培养

根据参考文献[8]方法,取出生24 h内SD大鼠,消毒,无菌条件下剪取心尖部心室组织,剪成均等小块后加入胰酶消化,吸取上清至含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中终止消化。重复消化至组织块消失。37℃差速贴壁1.5 h后收集原代心肌细胞,用含0.1 mmol/L 5-Brd U、10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞并按所需密度接种于培养板,置于37℃培养箱中培养。

1.3 RNA抽提和qPCR检测

收集处理后的原代心肌细胞,加入Trizol提取RNA。取1μg RNA,利用反转录试剂盒反转录为cDNA,其中miR-218和U6的反转录用特异颈环结构的引物。使用实时荧光定量PCR系统检测ANF、Ankrd1、GAPDH的表达水平,其中GAPDH为内参;检测miR-218和U6表达水平,其中U6为内参。

1.4 细胞免疫荧光染色

将原代心肌细胞接种于铺有玻片的24孔板中,用mimic miR-218及其对照mimic miR-NC、inhibitor miR-218及其对照inhibitor miR-NC分别转染细胞24 h,随后用生理盐水对照和Ang II分别处理细胞48 h。弃去培养基,PBS洗涤细胞,4%多聚甲醛室温固定0.5 h,0.5%Triton X-100(PBS稀释)透化10 min,5%BSA(PBS稀释)封闭1 h;1：200稀释的α-actinin抗体于37℃恒温孵育2 h,PBS充分洗涤后用TRITC标记的抗小鼠IgG荧光二抗(1：100)和DAPI(1：1000)于37℃孵育1 h;洗涤并置于载玻片,抗荧光猝灭剂封片,激光共聚焦显微镜观察、拍照记录;每组取200个心肌细胞利用软件NIS-Elements统计面积。

1.5 Western Blot检测

将原代心肌细胞接种到6孔板中,处理后收集细胞加入RIPA细胞裂解液,冰上涡旋震荡裂解30 min,13000 rpm离心15 min,收集上清。利用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度定量,12%SDSPAGE分离蛋白,转印至硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h后,Ankrd1和β-actin抗体分别于4℃孵育过夜,TBST漂洗,随后用HRP标记的二抗室温孵育1 h,TBST漂洗,ECL化学发光显影,其中β-actin为内参。

1.6 靶基因预测

利用生物信息学软件TargetScan和miRanda预测miR-218的靶基因。

1.7 双荧光报告基因检测

将HEK293ET细胞接种于24孔板,mimic miR-218和inhibitor miR-218及对照分别与psi-Check2-Ankrd1 3’UTR的野生型(Ankrd1-WT)报告质粒共转染HEK293ET细胞;mimic miR-218及其对照分别与Ankrd1-WT、突变型(Ankrd1-mut)报告质粒共转染HEK293ET细胞。24 h后收集细胞并裂解,利用双荧光报告基因试剂检测海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的活性,其中萤火虫荧光素酶活性作为内参。

1.8 统计学分析

采用Graph Pad Prism 5.0软件进行分析,计量数据用均数±标准差(¯x±s)表示,组间比较采用t-检验,P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Ang II处理后miR-218的表达变化

与对照组相比,Ang II处理后肥大指标ANF的表达增加,而miR-218表达下降。见图1。

2.2 miR-218过表达对心肌细胞面积的影响

Ang II处理后,mimic miR-NC组心肌细胞面积较对照组增大;mimic miR-218组比mimic miRNC组心肌细胞面积减小。见图2。

图1 miR-218的表达水平 （∗与对照组相比P＜0.05）

图2 miR-218过表达后的心肌细胞面积(∗∗∗与对照＋mimic miR-NC组相比 ＃＃＃与Ang II＋mimic miR-NC组相比P＜0.001)

2.3 miR-218敲低对心肌细胞面积的影响

经Ang II处理后,inhibitor miR-NC组心肌细胞面积较对照组增大,inhibitor miR-218组比inhibitor miR-NC组心肌细胞面积增大。见图3。

2.4 miR-218的靶基因预测

靶基因预测发现肥厚相关基因心肌锚定重复蛋白Ankrd1为miR-218的潜在靶向。Ang II处理原代心肌细胞48 h后,Ankrd1的mRNA水平和蛋白质表达水平均增加。见图4。

2.5 miR-218对Ankrd1表达的调控

与对照组相比,mimic miR-218显著降低了野生型报告基因的活性,inhibitor miR-218则显著增加了该报告基因活性(图5B);mimic miR-218与突变型质粒(图5A)共转染后,mimic miR-218对突变型质粒的抑制能力丧失(图5C)。用mimic miR-218和inhibitor miR-218及对照分别转染原代心肌细胞后发现,与对照组相比,mimic miR-218转染组Ankrd1蛋白表达水平明显降低(图5D),而inhibitor miR-218转染组Ankrd1蛋白表达水平明显升高(图5E)。

图3 miR-218敲低后的心肌细胞面积(∗与对照＋inhibitor miR-NC组相比P＜0.05 ＃与Ang II＋inhibitor miR-NC组相比P＜0.05)

图4 Ang II处理后Ankrd1表达变化（∗∗与对照组比较P＜0.01）

3 讨论

近来对miRNA在心肌肥厚中的作用取得了很多进展,研究揭示了不同的miRNA对心肌肥厚有着不同的影响。例如,肥大刺激因子异丙肾上腺素和醛固酮通过钙调神经磷酸酶下游的转录因子NFATc3直接激活miR-23a的转录,而miR-23a抑制抗肥大基因Mu RF1和Foxo3a的表达,敲低miR-23a能减轻异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚[9-10]。体内实验表明过表达miR-199a能通过激活m TOR信号通路,诱导心肌肥厚的发生[11]。另有文献报道具有抗心肌肥厚作用的miRNA包括有miR-1、miR-133等,在小鼠和人的心肌肥厚模型中均表达下调;抑制miR-133表达会诱导心肌肥厚,且肥大程度高于传统的肥大诱导剂效应[12]。Liu等[7]报道原代心肌细胞中过表达miR-218能抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大,主动脉弓缩窄诱导心肌肥厚后,小鼠心脏体重比显著增加,miR-218表达显著下调。本研究发现大鼠原代心肌细胞经Ang II处理后miR-218表达下调,miR-218过表达显著抑制了Ang II诱导的心肌细胞面积增大,而抑制miR-218能加剧心肌细胞的肥大。表明miR-218能抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大,证明了miR-218抑制心肌肥厚的效应。

图5 miR-218对Ankrd1表达的调控(∗∗∗与mimic miR-NC＋Ankrd-WT组相比P＜0.001 ＃与inhibitor miR-NC组相比P＜0.05)

Ankrd1在哺乳动物中的表达高度保守,是心肌发生的标志分子之一,在胚胎和胎儿发育时期高水平表达,直到成年时期表达水平进行性减少[13-14]。与利钠肽和β-肌球蛋白重链相似,Ankrd1基因也作为胎儿基因,在动物和人体心肌肥厚和心衰时表达增加[15]。扩张性心肌病或缺血性心脏病引起的晚期心力衰竭的患者中,左心室Ankrd1的表达水平上调[16]。在啮齿类动物的心肌肥厚模型中,也发现Ankrd1的表达上升[17]。Zhong等[18]报道Ankrd1敲低能抑制苯肾上腺素诱导的心肌肥厚。本研究结果显示,Ang II刺激心肌细胞肥大后,miR-218表达量下调,而Ankrd1表达上调,提示 miR-218和Ankrd1的表达在Ang II诱导的心肌细胞中存在负相关关系。进一步双荧光素酶报告基因实验和Western Blot表明miR-218能负调控Ankrd1的表达,表明Ankrd1是miR-218的靶基因,提示miR-218可能通过负调控靶基因Ankrd1抑制心肌细胞肥大。

Zhong等[18]研究显示Ankrd1招募GATA4和ERK1/2至肌节大分子复合物,从而增强GATA4的磷酸化,随后Ankrd1复合物转位至细胞核内诱导肥大基因的表达,促进苯肾上腺素诱导的心肌肥厚。Chen等[19]发现给TAC造模的小鼠心肌内注射Ankrd1重组腺病毒能显著增强细胞浆Ankrd1的水平以及心脏体重比,而特异性敲低Ankrd1能抑制TAC诱导的心肌肥厚;机制研究发现Ankrd1通过激活钙依赖磷酸酶/NFATc3通路促进Ang II和TAC诱导的心肌肥厚。本研究中发现miR-218能抑制Ankrd1的表达,提示miR-218可能通过Ankrd1增强GATA4的磷酸化或激活钙依赖磷酸酶/NFATc3通路调控心肌肥厚,其具体机制仍需进一步研究。

综上,本研究表明miR-218在Ang II诱导的心肌细胞肥大中具有保护作用,其作用机制可能与负调控肥大相关基因Ankrd1表达相关。