苹果醋发酵用醋酸杆菌的筛选与鉴定

李华敏，李林，黄萍萍*，刘文丽，潘敏，庄若茹

(1.鲁东大学 食品工程学院，山东 烟台 264025；2.烟台市粮油质量检测中心，山东 烟台 265301)

果醋是以水果(包括苹果、葡萄、梨、猕猴桃、柑橘、柿子等)为主要原料，利用酵母菌和醋酸杆菌二次发酵酿制而成的一种营养丰富、风味优良的酸味调味品，其兼具水果和食醋的营养保健性能，有着巨大的市场潜力[1-3]。在众多果醋中，苹果醋具有苹果果香，因其富含醋酸、苹果酸、琥珀酸和氨基酸等而使醋的风味独特、酸味适度，同时苹果资源丰富，苹果醋生产工艺简单，使其成为市场占有率最高的果醋产品[4-7]。苹果醋有苹果和食醋的双重营养保健功效，除了具有调味品的调酸、增加食欲和抗菌防腐活性外，还具有降血压、抗衰老、防氧化、促进新陈代谢、维持体内酸碱平衡等功能[8-10]。苹果醋的加工生产不仅可以提高苹果的利用率，更可以延长苹果种植业和加工业的产业链，从而提高苹果的附加值，增加经济效益[11]。

醋酸发酵过程对苹果醋的产量和品质影响较大，优良的醋酸菌菌种是影响苹果醋品质的关键因素之一[12,13]。目前，国内苹果醋酿造使用的醋酸菌大都为食醋菌种AS1.41(Acetobacterrancensvar.tubidans)和沪酿1.01(A.pasteurianussubsp.pasteurianus)，不仅产酸能力、耐酒精能力有限，而且发酵果醋形成的风味也不佳，因此需选育优良的果醋专用醋酸菌[14,15]。本研究选用烟台地区的苹果进行自然果醋发酵，从自然发酵的果醋和果园土壤中筛选醋酸杆菌，以获得更适合烟台苹果和本地区气候的醋酸杆菌。

1 材料与方法

1.1 材料

红富士苹果：采摘于山东烟台苹果园；土壤：取自山东烟台苹果园。

1.2 培养基

醋酸菌富集培养基：葡萄糖1%，酵母膏1%，KH2PO40.5%，pH 5.5，121 ℃灭菌30 min；灭菌后冷却至70 ℃时添加3%(V/V)的无水乙醇。

醋酸菌分离培养基：葡萄糖1%，酵母膏1%，琼脂2%，CaCO32%，乙醇3%，121 ℃灭菌30 min；CaCO3于165 ℃干热灭菌30 min，灭菌后添加无水乙醇和CaCO3。

斜面培养基：葡萄糖1%，酵母粉1%，CaCO32%，琼脂粉2%，自然pH值。

基础培养基：葡萄糖1%，酵母粉1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，ZnSO40.01%，乙醇6%，自然pH值。

1.3 试剂

革兰氏染液：南京建成科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、Taq PCR Mastermix、GeneGreen核酸染料、500 bp DNA Ladder：天根生化科技(北京)有限公司；酵母膏、酵母粉、琼脂粉：均为生化试剂；其他试剂：均为分析纯。

1.4 仪器与设备

生物显微镜 日本奥林巴斯公司；台式离心机 上海安亭科学仪器厂；超低温冰箱 青岛海尔特种电器有限公司；FE20K pH计 瑞士梅特勒-托利多公司；立式压力蒸汽灭菌锅、摇床 龙口市先科仪器公司；恒温培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.5 实验方法

1.5.1 菌种富集

100 mL鲜榨苹果汁加入到250 mL无菌三角瓶中，30 ℃静止发酵6周，选醋酸味浓郁的自然发酵样品，进行分离筛选。

称取1 g土壤样品，放入装有9 mL无菌水的大试管中，震荡后静置5 min，然后将浓度梯度稀释到10-3，从10-3土壤稀释液中吸取l mL加入到20 mL富集培养基中，30 ℃，150 r/min，培养2～3天。

1.5.2 平板分离

分别取上述富集培养液1 mL，加入到装有9 mL无菌水的大试管中，混匀，依次进行10倍浓度梯度稀释，分别取10-5，10-6，10-7稀释液涂布在分离平板上，30 ℃培养2～3天。

1.5.3 纯化

挑取透明圈较大，菌落形态一致，生长占优势的单菌落划线纯化，30 ℃培养2～3天。

1.5.4 产酸定性实验[16]

将分离纯化的菌种接种于基础培养基中，30 ℃培养3天，6000 r/min离心5 min，除去发酵液中的菌体，取5 mL上清液用1 mol/L的NaOH溶液中和至pH为7.0，加入5%的FeCl3溶液5～6滴，煮沸，形成红褐色沉淀者为醋酸菌。

1.5.5 产酸能力测定[17]

将上述筛选出的醋酸菌二次活化后，接种基础培养基，30 ℃，150 r/min培养。比较第5天的产酸量，选出产酸量高的菌株。取2 mL二次培养的菌液，加入50 mL蒸馏水，并滴加2～3滴酚酞试剂，用标定的0.1 mol/L NaOH进行中和滴定，直到溶液变成浅粉色，由耗用的NaOH溶液的体积计算样品中的含酸量(以醋酸计)。

产酸量(g/L)=(V-V0)×CNaOH×60/L。

式中：V为发酵液样品滴定耗用的NaOH毫升数；V0为以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH毫升数；CNaOH为NaOH溶液的浓度(mol/L)；L为样品的毫升数；60为醋酸的分子量。

1.5.6 耐乙醇能力测定

将菌株接种于50 mL基础培养基，30 ℃，120 r/min，培养24 h后转接入乙醇含量分别为4%，6%，8%，10%的基础培养基，静置培养5天后分别测定产酸量并比较，每个菌株做3个平行。

1.5.7 醋酸菌菌株鉴定[18]

形态特征观察：观察菌株的固体平板菌落形态，对筛选到的菌株进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌体细胞形态。

基因组DNA的提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技)，使用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCAG-3')和1492R(5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3')扩增16S rDNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测无误后，PCR产物送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行纯化、测序。

1.5.8 醋酸菌菌株系统发育树的构建

将菌株序列在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对分析，利用Mega 7.0软件构建系统发育树[19]，进而确定其种属地位。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与初筛

分离纯化：从自然发酵苹果醋和苹果园土壤中共分离筛选到22株透明圈较大(透明圈直径与菌落直径的比值大于2)的产酸菌，透明圈结果见图1。

图1 菌落产生的透明圈Fig.1 The transparent circle of colonies

初筛：通过革兰氏染色和产酸定性实验，发现其中19株菌为革兰氏阴性菌，并能生成红褐色沉淀，表明这19株菌为醋酸菌，分别标记为YT01～YT19。

2.2 产酸量测定

测定19株醋酸菌第5天的产酸量，结果见表1。

表1 19株菌的产酸量Table 1 The acetic acid yield of 19 strains

由表1可知：YT06，YT10，YT12，YT14和YT17 5株菌的产酸量最大，分别为14.92，15.08，14.18，13.28，16.82 g/L。

2.3 耐乙醇能力测定

对以上5株菌的耐乙醇能力进行测定，结果见表2。

表2 各菌株在不同乙醇浓度下的产酸量Table 2 The acetic acid yield of different strains at different ethanol concentration

由表2可知，这5株菌在乙醇浓度为8%时，产酸量明显下降，而在乙醇浓度为6%时产酸量最大。其中，菌株YT17在6%乙醇浓度下产酸量达到16.45 g/L。

2.4 产酸曲线测定

图2 产酸量曲线Fig.2 The curve of acid yield

对这5株菌的产酸量进行比较，由图2可知，菌株YT17的产酸量最大，在第8天时产酸量达到27.91 g/L，但产酸速度明显下降。

2.5 分离菌株的分子生物学鉴定

提取菌株YT06，YT10，YT12，YT14和YT17的全基因组，使用通用引物27F和1492R扩增其16S rDNA序列，对全基因组DNA和PCR扩增的16S rDNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3和图4。PCR产物送交上海生工进行纯化、测序。

图3 菌株基因组DNA电泳结果Fig.3 Genomic DNA of different strains

图4 PCR扩增产物电泳结果Fig.4 Electrophoresis results of PCR product

2.6 分离菌株的系统发育树构建

将5株菌的16S rDNA序列在NCBI上进行BLAST比对，下载与此序列同源性高的序列，利用Mega 7.0软件构建菌株系统发育树，系统发育树结果见图5。分离得到的5株醋酸菌按照亲缘关系分属于3个种：桃醋酸杆菌(Acetobacterpersici)：YT06；苹果醋杆菌(Acetobactermalorum)：YT12，YT14；芝庇侬醋杆菌(Acetobactercibinongensis)：YT10，YT17。

图5 系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree

3 结论

本研究从自然发酵的苹果醋和苹果园土壤中筛选到19株醋酸菌，菌株YT06，YT10，YT12，YT14和YT17的产酸能力较好，在乙醇浓度为6%时产酸量最大，其中菌株YT17在第8天时产酸量达到27.91 g/L，对这5株菌进行分子生物学鉴定，发现按照亲缘关系分属于3个种：桃醋酸杆菌(Acetobacterpersici)：YT06；苹果醋杆菌(Acetobactermalorum)：YT12，YT14；芝庇侬醋杆菌(Acetobactercibinongensis)：YT10，YT17。