热带醋酸杆菌B104发酵条件的优化研究

朱运平，李大为，张 雪，黄月宜，李秀婷 *，梁治军，孙宝国

（1.北京市食品添加剂工程技术研究中心 北京工商大学，北京 100048；2.食品添加剂与配料北京高校工程研究中心 北京工商大学，北京 100048；3.食品质量与安全北京实验室 北京工商大学，北京 100048；4.河南省淼雨饮品股份有限公司，河南 焦作 454191）

果醋被誉为“21世纪的食品”，愈来愈受到人们的重视[1-3]。与传统的粮食醋相比，果醋的果味突出、香气袭人、兼具水果和食醋的营养保健功能。研究发现，果醋中含有多种必需氨基酸、有机酸以及各种维生素等，具有提高机体免疫力、防癌抗癌等作用[4-5]。目前果醋产品在发达国家市场已经相当普遍，而在我国由于果醋生产技术的相对落后、品种的相对单一、专用菌种的缺少、现有菌种的产酸能力有待提高等问题，尚未形成完善的果醋市场。

果醋发酵和良好风味的形成离不开醋酸菌菌种，我国在醋酸菌菌种的选育和应用方面进行了大量的研究[6-7]。目前我国果醋加工常用的菌种仍为恶臭醋酸杆菌（Acetobacter rancens）As1.41和沪酿1.01[8-13]。菌种的筛选主要集中于具有耐高温、高酒精等特性的菌株[14-16]。另外，纯培养的醋酸菌容易变形死亡，培养菌种的筛选、优化等直接关系到发酵的成功与否。所以，对菌株发酵条件优化是必要的。目前尚未见热带醋酸杆菌（Acetobacter tropicalis）用于果醋制备的研究报道较少。仅有为数不多的几篇文献报道了热带醋酸杆菌在其他领域的应用。如任播杨[17]的研究表明，热带醋酸杆菌能够改善养殖水体水质条件，促进罗非鱼的生长，是提高罗非鱼肠道消化酶活性和血清非特异性免疫活性的微生态制剂。SOEMPHOL W等[18-19]的研究表明，热带醋酸杆菌SKU1100具有很好的耐热性能，甚至可以在42 ℃以上的条件中生长，还可以诱变产多糖缺陷菌株产生一种由半乳糖、葡萄糖和鼠李糖组成的薄皮多糖，并依附在细胞的表面上。

本研究从自然发酵的苹果醋醪中筛选鉴定得到1株性能与恶臭醋酸杆菌（Acetobacter rancens）As1.41相当的热带醋酸杆菌（Acetobacter tropicalis）B104，并以菌株产酸量为评价指标，分别从发酵方式、接种量、培养温度、摇床转速、培养基初始pH值、碳源、氮源等因素对热带醋酸杆菌（Acetobacter tropicalis）B104的发酵培养条件和培养基成分进行了优化，为热带醋酸杆菌B104在果醋加工和应用方面提供有力的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

热带醋酸杆菌（Acetobacter tropicalis）B104：本实验室从自然发酵的苹果醋醪中筛选鉴定得到。

1.1.2 试剂

无水乙醇、氢氧化钠（NaOH）：北京化工厂；葡萄糖：西陇化工股份有限公司；丙三醇、盐酸（HCl）：国药集团化学试剂有限公司；酵母膏、琼脂：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.3 培养基

斜面保藏培养基：葡萄糖1.0 g，酵母膏0.5 g，琼脂2.0 g，丙三醇2.5 mL，水100 mL，121 ℃条件下灭菌20 min，冷却后加入体积分数为3%的无水乙醇。

基础培养基：葡萄糖1.0 g，酵母膏1.0 g，pH值为5.5，水100 mL，121 ℃条件下灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

JY2002电子天平：上海精密科学仪器有限公司；PHS-3CpH计：上海精密科学仪器有限公司；DL-CJ-2ND I超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；YQX-SG46-280S高压蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TENSUC恒温摇床：上海天呈实验仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 热带醋酸杆菌B104的斜面培养及扩大培养

将热带醋酸杆菌B104的接种于斜面培养基，置于30 ℃恒温培养箱中培养2 d。从斜面培养基上刮取热带醋酸杆菌B104菌落接种到基础培养基中，30 ℃、120 r/min的条件下摇床培养12 d，按照4%的接种量转接到发酵培养基中。

1.3.2 发酵方式对菌株产酸量的影响

在温度30 ℃，葡萄糖质量浓度10.0 g/L，无水乙醇体积分数5.0%，酵母膏质量浓度10.0 g/L，初始pH值为5.5，接种量4.0%条件下。摇瓶发酵采用装液量50 mL/250 mL，转速120 r/min，分别采用静置培养和摇瓶培养12 d，考察不同发酵方式对菌株产酸量的影响。

1.3.3 菌株产酸量的检测方法及计算公式

菌株产酸量采用酸碱滴定法：取2 mL发酵液于三角瓶内，加入50 mL蒸馏水，3～5滴0.5%酚酞酒精溶液，用标定的0.1 mol/L的氢氧化钠溶液滴至浅粉红色，由耗用的氢氧化钠溶液体积计算样品中的产酸量。每个菌株进行3个平行处理，取平均结果。产酸量计算公式：

产酸量（g/L）=（V-V0）×CNaOH×0.060×1 000

式中：V为发酵液样品消耗的氢氧化钠溶液的体积，mL；V0为以空白培养基为对照耗用的氢氧化钠溶液体积，mL；CNaOH为氢氧化钠溶液的浓度，mol/L；0.060为醋酸分子的折算系数。

1.3.4 培养条件的优化

（1）接种量对菌株产酸量的影响

采用摇瓶培养方式，接种量分别为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%，其他培养条件不变，发酵12 d，考察接种量对菌株产酸量的影响。

（2）培养温度对菌株产酸量的影响

采用摇瓶培养方式，培养温度分别为28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃，其他培养条件不变，发酵12 d，考察培养温度对菌株产酸量的影响。

（3）摇床转速对菌株产酸量的影响

转速分别设置为100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min，其他培养条件不变，发酵12 d，考察摇床转速对菌株产酸量的影响。

（4）初始pH值对菌株产酸量的影响

用1 mol/L HCl或NaOH溶液调节培养基初始pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，其他培养条件不变，发酵12 d，考察初始pH值对菌株产酸量的影响。

1.3.5 培养基成分的优化

（1）碳源对菌株产酸量的影响

在单因素试验基础上，选择葡萄糖及无水乙醇作为最适碳源。葡萄糖质量浓度分别为0、10.0 g/L、30.0 g/L、50.0 g/L、70.0 g/L、90.0 g/L。无水乙醇体积分数分别为0、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%，在优化的培养条件下发酵12 d，考察葡萄糖及无水乙醇添加量对菌株产酸量的影响。

（2）氮源对菌株产酸量的影响

在单因素试验基础上，选择酵母膏作为最适氮源。酵母膏质量浓度分别为5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L、20.0 g/L、25.0 g/L、30.0 g/L，在优化的培养条件下发酵12 d，考察酵母膏添加量对菌株产酸量的影响。

2 结果与分析

2.1 培养条件优化结果

2.1.1 发酵方式对菌株产酸量的影响

通过静置培养和摇床培养来研究不同发酵方式对菌株产酸量的影响。发酵方式对菌株产酸量的影响结果如图1所示。

由图1可知，在发酵过程中，氧气作为醋酸菌氧化乙醇为醋酸的底物，搅拌可增加培养基中的溶氧，所以搅拌有利于醋酸杆菌产酸反应的进行。热带醋酸杆菌B104在静置培养和摇床培养下的第12天产酸量达到最大，产酸量分别为28.1 g/L和36.2 g/L。结果表明，摇床培养条件下热带醋酸杆菌B104产酸量明显高于静置培养，因此以下实验均采取摇床发酵12 d的方式进行。

图1 发酵方式对热带醋酸杆菌B104产酸量的影响Fig.1 Effect of fermentation mode on acid production by Acetobacter tropicalis B104

2.1.2 接种量对菌株产酸量的影响

当菌体接种量适量时，发酵产物的产量与菌体接种量是正比关系；但当菌体接种量过大时，营养物质过快消耗，有毒物质迅速积累，培养液营养成分发生明显改变等都会对发酵过程产生很大影响。接种量对菌株产酸量的影响结果如图2所示。

图2 接种量对热带醋酸杆菌B104产酸量的影响Fig.2 Effect of inoculum on acid production by Acetobacter tropicalis B104

由图2可知，当菌体接种量＜4.0%时，菌株的产酸量随着接种量的增加而升高，在接种量为4.0%时，产酸量达到最大值39.7 g/L，随着接种量的增加，菌株的产酸量呈现下降趋势。所以热带醋酸杆菌B104的最佳接种量为4.0%。王玉冰等[16]研究表明，接种量不同对醋酸菌的产酸结果有不同的影响，接种量过小，菌体生长缓慢，延长了发酵的周期，使生产效率降低；接种量过大，菌体生长旺盛，因此大量的营养物质被消耗，导致菌体过早衰老死亡，降低了原料的转化率。

2.1.3 摇床转速对菌株产酸量的影响

菌株生长需要适合氧气，当溶氧速率大于菌体的耗氧速时，菌体能正常生长，否则菌体生长缓慢或不生长。摇床转速对菌株产酸量的影响结果如图3所示。

图3 转速对热带醋酸杆菌B104产酸量的影响Fig.3 Effect of rotation speed on acid production by Acetobacter tropicalis B104

由图3可知，摇床转速为100～120 r/min时，随着摇床转速的增加，菌株的产酸量呈增加趋势，当摇床转速为120～200 r/min时，随着摇床转速的增加，菌株的产酸量缓慢下降。摇床转速120 r/min时热带醋酸杆菌B104的产酸量最大，为40.1 g/L。宋勇强等[20]研究表明，当到达发酵最适转速时，即达到了溶解氧的供需平衡，此时发酵液中的溶氧可以满足菌体的生长需求，高或低都会影响菌体生长和产酸。

2.1.4 培养温度对菌株产酸量的影响

温度是微生物生长的重要环境条件之一。任何微生物只能在一定的温度范围内生存，在适宜的范围内大量繁殖。培养温度对菌株产酸量的影响结果如图4所示。

图4 培养温度对热带醋酸杆菌B104产酸量的影响Fig.4 Effect of cultivation temperature on acid production by Acetobacter tropicalis B104

由图4可知，当培养温度较低的时候，菌株的产酸量也较低，随着温度的升高，当培养温度为30 ℃时，菌株的产酸量最高，为44.2 g/L。当培养温度继续升高，菌株的产酸量却呈现下降趋势。所以热带醋酸杆菌B104最适培养温度为30 ℃。姜晓芝等[21]研究表明，影响醋酸菌生长繁殖最重要的因素之一就是培养温度。在一定温度范围内，菌体的生长繁殖和代谢活动会随着温度的升高而加强。当温度上升到一定程度，开始对菌体产生不利的影响，若继续升高温度，高温会使菌体细胞的核酸变性、细胞膜溶解、蛋白质结构遭到破坏，使菌体的细胞功能急剧下降以至死亡。

2.1.5 初始pH对菌株产酸量的影响

培养基pH值对微生物酶系的组成、结构以及酶解过程都会产生明显的影响，从而影响菌株的产酸量。培养基初始pH对热带醋酸杆菌产酸量的影响结果见图5所示。

图5 初始pH对热带醋酸杆菌B104产酸量的影响Fig.5 Effect of initial pH on acid production by Acetobacter tropicalis B104

由图5可知，在初始pH值为4.0时菌株的产酸能力较低，随着pH值的升高，菌株的产酸量增加，在pH值为5.5时产酸量达到最高，为45.1 g/L，随着pH值的再升高，菌株的产酸量逐渐降低。所以在发酵产酸过程中，热带醋酸杆菌B104最佳初始pH值为5.5。宋勇强等[20]研究表明，初始pH的变化，会使发酵液的醋酸含量呈现出先升高后下降的趋势。初始pH过高或过低都不利于菌株生长繁殖和产酸。

2.2 培养基组成的优化结果

2.2.1 碳源（葡萄糖、乙醇）添加量对菌株产酸量的影响

葡萄糖、无水乙醇的添加量对菌株产酸量的影响结果如图6所示。

由图6A可知，当葡萄糖的质量浓度＜10.0 g/L时，随着葡萄糖浓度的升高，菌株的产酸量增加，当葡萄糖质量浓度达到10.0 g/L时，菌株的产酸量最大，为52.1 g/L，之后随着葡萄糖质量浓度的提高，菌株的产酸量却呈现了下降趋势。所以在醋酸菌的发酵产酸过程中，10.0 g/L葡萄糖添加量最利于热带醋酸杆菌B104的生长繁殖和产酸。易九龙等[21]研究表明，在无葡萄糖时，醋酸菌主要以乙醇为碳源进行生长繁殖及产酸代谢，但产酸量较低。随着葡萄糖浓度的升高，菌株的产酸量增加，但当葡萄糖浓度过高时会使菌体细胞的渗透压升高，不利于其生长代谢，从而影响菌株发酵产酸能力。由图6B可知，当无水乙醇的添加量为5.0%时，菌株的产酸量达到最高53.1 g/L，无水乙醇添加量＜5.0%的范围内，菌株的产酸量随着无水乙醇添加量的增大而增加，无水乙醇添加量＞5.0%时，菌株的产酸量随着添加量的不断增加而逐渐降低。所以在醋酸菌发酵产酸过程中，热带醋酸杆菌B104的最佳无水乙醇添加量为5.0%。姜晓芝等[22]研究表明，当无水乙醇添加量过高时，菌体过度繁殖，使得大部分菌体细胞迅速衰老，从而影响醋酸菌的产酸量。

图6 葡萄糖(A)及无水乙醇(B)添加量对热带醋酸杆菌B104产酸量的影响Fig.6 Effect of glucose(A)and ethanol(B)addition on acid production by Acetobacter tropicalis B104

2.2.2 酵母膏添加量对菌株产酸量的影响

酵母膏的添加量对菌株产酸量的影响结果如图7所示。

图7 氮源添加量对热带醋酸杆菌B104产酸量的影响Fig.7 Effect of nitrogen source concentration on acid production by Acetobacter tropicalis B104

由图7可知，当酵母膏的质量浓度为20.0 g/L时菌株的产酸量达到最高水平，为55.4 g/L，酵母膏质量浓度＜20.0 g/L的范围内，菌株的产酸量随着酵母膏浓度的增大而增加，酵母膏质量浓度＞20.0 g/L，菌株的产酸量随着质量浓度的不断增加而逐渐降低。所以在醋酸菌发酵产酸过程中，热带醋酸杆菌B104的最佳酵母膏添加量为20.0 g/L。

3 结论

本研究从实验室自然发酵的苹果醋醪中筛选鉴定得到1株性能较为优良的热带醋酸杆菌（Acetobacter tropicalis）B104，并对该菌株生长繁殖的最佳培养条件和培养基组成为接种量为4.0%，培养温度30 ℃，摇床转速120 r/min，培养基初始pH 5.5，10.0 g/L葡萄糖和体积分数为5.0%的无水乙醇为碳源，20.0 g/L酵母膏为氮源。在此条件下培养12 d，该株菌的产酸量可以达到55.4 g/L，是优化前的1.5倍。通过优化该菌株发酵工艺参数，提高了该菌株的产酸能力，为其在果醋制备中的应用奠定了基础。

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