微生物发酵生产高品质番茄红素的研究进展

王红波，吴 华，陈禅友，刘 琴，潘 磊，郭 瑞，胡志辉

（江汉大学 生命科学学院 湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心，湖北 武汉 430056）

番茄红素（lycopene）是红色的脂溶性色素，不溶于水，微溶于甲醇和乙醇，分子式为C40H56。番茄红素主要由反式、9-顺式、13-顺式及15-顺式四种异构体组成[1]，顺式结构的番茄红素生物利用度及抗氧化功能皆优于反式结构的番茄红素[2]，且营养价值更高。番茄经加热处理，其中的反式番茄红素会顺式异构生成顺式番茄红素，有利于提高番茄红素的营养价值。番茄红素多见于西红柿，其抗氧化活性约为β-胡萝卜素的2倍[3]。番茄红素对人体健康的功效促进了番茄红素在食品工业中的商业化发展。目前，食用番茄是人体获取番茄红素的主要方式。番茄红素能减小机体细胞被活性氧自由基的氧化损伤，预防直肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌和皮肤癌，降低血液中胆固醇的含量，预防血清脂质过氧化和心脑血管疾病[4-10]。其他种类的类胡萝卜素（包括β-胡萝卜素）还未发现有显著预防癌症和心脑血管疾病的功能[11-12]。番茄红素作为一种优良的抗氧剂，已被广泛运用于食品、化妆品和医药领域，市场前景良好。

番茄红素的分子结构式[13]：

用化学合成方法制备的番茄红素由于副产物多，食品安全风险大，其市场前景局限性较大[14]。因此，天然的番茄红素市场前景被看好，正成为食品添加剂、化妆品以及医药领域的研究热点[15]。目前，天然番茄红素的制备途径主要有两个：一是从番茄组织中提取；二是通过微生物发酵生物合成。番茄中番茄红素含量低，约占番茄干物质的0.05%～0.10%[16]。番茄资源短缺以及番茄中番茄红素含量不稳定都会严重影响从番茄中连续工业化提取番茄红素的要求。用微生物发酵的方法生产番茄红素，突破了番茄资源短缺和番茄红素品质不稳定的限制，是最具工业化前景的制备天然番茄红素的有效方法。番茄红素的天然资源包括水果、蔬菜和微生物。微生物发酵的方法比从水果和蔬菜中提取的方法，在生产天然番茄红素方面优势突出[17]。

1 重组大肠杆菌发酵生产番茄红素

用改造了代谢途径的微生物生产有益的类胡萝卜素是有希望取代植物细胞提取高效生产天然类胡萝卜素的良好方法。HARADA H等[18]描述了用导入了外源甲羟戊酸途径的大肠杆菌高效合成类胡萝卜素的方法。发酵培养基中添加乙酰乙酸锂，具有番茄红素合成质粒的重组大肠杆菌中番茄红素的含量能达到12.5 mg/g，番茄红素的含量比不添加乙酰乙酸锂的对照组增加了11.8倍。基因工程菌株不稳定，需要持续的选择压力才能保持质粒的稳定。CHEN Y Y等[19]克服了这个不足，构建了不携带质粒和抗性标记的能合成番茄红素的重组大肠杆菌。重组菌株通过三氯生诱导染色体进化获得了基因高拷贝表达系统。即使发酵过程缺乏选择试剂，工程菌株仍表现出良好的遗传稳定性。用T5启动子替换大肠杆菌固有的appY启动子，并且敲除了iclR基因的大肠杆菌，其番茄红素的合成能力进一步得到提高，番茄红素的含量达到33.43 mg/g。ZHOU Y等[20]在敲除了6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf 的大肠杆菌中，进一步上调甲羟戊酸途径限速酶基因idi（克隆异戊烯二磷酸异构酶）和dxs（克隆1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶）的表达，增加了番茄红素的含量，番茄红素的含量达到了6.85～7.55 mg/g。SUN T等[21]敲除了生产β-胡萝卜素大肠杆菌CAR001中的玉米黄素葡糖糖基转移酶基因crtX和番茄红素环化酶基因crtY；调控α酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和转醛醇酶B的表达，增加还原型辅酶Ⅱ（triphosphopyridine nucleotide，NADPH）和腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的供应；调控1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因dxs、异戊烯二磷酸异构酶基因idi和crt 基因操纵子的表达。分批发酵时，优化后的菌株LYC010，其番茄红素的含量达到50.6 mg/g。ZHU F等[22]研究了定向改造甲羟戊酸途径过量合成法尼烯，构建了番茄红素生产重组大肠杆菌L3，在2.5 L发酵液分批发酵，产量达到1.44 g/L，当发酵规模扩大到100 L时，发酵32 h，番茄红素的产量达到1.23 g/L，番茄红素含量达到34.3 mg/g，番茄红素最大的生产效率达到74.5 mg/（L·h），且重组菌株L3容易放大生产，有希望取代番茄红素传统的生产菌株三孢布拉霉工业化发酵生产番茄红素。KIM Y S等[23]用葡萄糖和L-阿拉伯糖作为重组大肠杆菌生产番茄红素的主要碳源甘油的辅助碳源，能有效促进菌体的生长和番茄红素的生物合成，研究表明，在补料分批发酵过程中，添加10 g/L和7.5 g/L的葡萄糖和L-阿拉伯糖，生物量达到42 g/L，番茄红素的含量达到了32 mg/g，分别比甘油作为单一碳源时提高了3.9和1.9倍。ZHANG T C等[24]研究表明，重组大肠杆菌在添加了6 g/L果糖的溶菌肉汤（lysogeny broth，LB）培养基上生长，能有效增加番茄红素的产量，而葡萄糖作用很小，在250 mL三角瓶中，发酵24 h，番茄红素的产量达到1 050 mg/L。

2 三孢布拉霉发酵生产番茄红素

三孢布拉霉（Blakeslea trispora）菌体属于接合菌门、接合菌纲、毛霉目、笄霉科、布拉霉属[25]，其生长的过程表现为菌丝延长以及细胞核裂殖增多。在固体培养基上生长时，首先形成营养菌丝和气生菌丝，最后生成菌苔，并萌发出孢子；在液体培养基中生长时，菌丝体会互相缠绕，最后形成菌丝球。三孢布拉霉菌体是异宗的接合菌，有正菌和负菌两种单性菌株。正菌和负菌按照1∶1～1∶10的比例混合发酵生产类胡萝卜素。三孢布拉霉菌体中类胡萝卜素的成分少，几乎仅能生成β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素以及番茄红素，是目前唯一能够用来工业化发酵生产β-胡萝卜素和番茄红素的微生物[26-28]，其中以β-胡萝卜素为主，通常能达到85%以上。

为了生产高纯度的番茄红素，三孢布拉霉菌体中的番茄红素环化酶活性需完全抑制。因此番茄红素环化酶抑制剂的抑制效果是用三孢布拉霉发酵生产高品质番茄红素的关键。番茄红素环化酶抑制剂主要有咪唑类化合物，吡啶类化合物物以及吖嗪类化合物[26]。根据已有的研究报道，常用的环化酶抑制剂有咪唑、吡啶、哌啶、烟酸、三乙胺和肌酐[29]。CHOUDHARI S M等[30]研究了用不同质量浓度（100 mg/L、500 mg/L、750 mg/L、1 000 mg/L）的咪唑、哌啶、三乙胺、吡啶、胡椒基丁醚、烟酸和肌酐用作环化酶抑制剂来生产番茄红素。其研究结果表明，用500 mg/L的哌啶作为环化酶抑制剂，番茄红素的纯度能接近95%，抑制效果良好。PEGKLIDOU K等[31]用2-甲基咪唑作为环化酶抑制剂，菌体生长达到平衡期时，培养基中添加50 mg/L的2-甲基咪唑，番茄红素的纯度能达到94%。优良的番茄红素环化酶抑制剂需具备以下几个特征：用量少，抑制效果好，水溶性好，能降解。WANG H B等[32]用300 mg/L的2-异丙基咪唑，能完全抑制番茄红素环化酶的活性，类胡萝卜素中番茄红素的含量能达到96%，2-异丙基咪唑为水溶性，易从番茄红素中水洗分离，食品安全性高。2-异丙基咪唑可能会被活性污泥中假单胞菌降解，环境污染风险低。XU F等[33]在三孢布拉霉菌体发酵培养基中添加体积分数为1%的正己烷和正十二烷作为氧载体，番茄红素产量分别提高了51%和78%，并且正十二烷和乳化剂司班-20一起使用效果更好。辅酶Q和麦角固醇的生物合成是番茄红素合成途径的两个主要代谢支流[34]。辅酶Q和麦角固醇的合成会降低番茄红素的合成能力，进而减小番茄红素的产量，抑制辅酶Q和麦角固醇的生物合成能增加番茄红素的产量。SUN Y等[35]分别用0.7 mg/L盐酸特比萘芬和30 mg/L酮康唑分别作为麦角固醇生物合成的抑制剂，番茄红素的产量分别增加了23%和277%。SHI Y等[36-37]研究了在三孢布拉霉菌体的发酵培养基中添加异戊烯基化合物和代谢前体来提高番茄红素的产量，研究结果表明，发酵42 h后，发酵液中添加质量浓度为42 mg/L的香叶醇效果最佳，番茄红素的产量达到578 mg/L，比未添加香叶醇的对照组提高了62%。

3 结论与展望

用重组大肠杆菌发酵生产番茄红素。由于重组大肠杆菌中导入了外源的甲羟戊酸途径和番茄红素合成酶相关基因，发酵培养基中需要持续的选择压力，以免外源质粒的丢失，重组大肠杆菌合成番茄红素的稳定性较差。但用重组大肠杆菌生产番茄红素也有显著的优势，发酵周期短，48 h内即可完成发酵，发酵培养基价格低廉，发酵成本低。因此，提高重组大肠杆菌合成番茄红素的稳定性是用重组大肠杆菌发酵生产番茄红素的研究重点。用三孢布拉霉菌体发酵生产番茄红素，菌体合成番茄红素稳定性好，食品安全性较大肠杆菌高，但发酵周期长，需120 h以上才能完成发酵，耗氧量高，发酵培养基价格昂贵，发酵成本高。因此，降低发酵成本是用三孢布拉霉菌体发酵生产番茄红素的研究重点。

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