番茄红素在微乳液制备和贮藏过程中构型转化及稳定性研究

王晓文 ， 张华伟 ， 闫圣坤 ， 李 婧 ， 李 红 ， 张连富 *，2

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122；2.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡21412）

番茄红素是一种直链型碳氢化合物，分子中含有11个共轭双键和2个非共轭双键，理论上存在2 048种立体异构体，实际可能存在的异构体种类也有72种[1]。人和动物自身不能合成番茄红素，人体内的番茄红素来源于膳食，以番茄及番茄制品、西瓜、番石榴、木瓜为主[2]。近年来，一些实验研究表明，番茄红素比其它类胡萝卜素有更强的淬灭单线态氧自由基的能力[3]，其能力是β-胡萝卜素的2倍、α-生育酚的100倍[4]；番茄红素可以降低某些癌症（如乳腺癌、消化道癌、前列腺癌）的发病几率，可以预防心血管疾病[5-6]。

番茄红素作为一种功能性天然红色素，被广泛应用于保健食品、医药和化妆品中。番茄红素高度不饱的结构导致它的稳定性很差，因此番茄红素在加工的过程中容易发生氧化降解和顺反异构化反应，经热处理制备得到的番茄红素制品中发现了顺式异构体[7-8]。尤其在高温处理过程中番茄红素异构化非常明显，番茄红素的氧化降解和异构化不仅影响含番茄红素制品的色泽，进而影响番茄红素制品的营养价值。一些研究表明，顺式结构的番茄红素更容易被人体吸收，并且较全反式的番茄红素具有更强的生理效能[9]，番茄红素制品的生物效能不仅与番茄红素的含量有关而且也与番茄红素的异构化有关。有关水溶性番茄红素微乳液在加工过程中番茄红素结构变化、番茄红素微乳液在不同贮藏条件下贮藏所引起的番茄红素氧化和异构化的的研究比较少，因此，研究番茄红素微乳液在加工和贮藏过程中番茄红素的氧化和异构化，对于正确地选择加工工艺和贮藏条件至关重要。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

番茄红素（质量分数为90%）：华北制药股份有限公司产品；中链甘油三酸酯：食品级，浙江建德市千岛精细化工有限公司产品；抗氧化剂：食品级，广州泰邦食品添加剂有限公司产品；吐温40：食品级，广州市润华食品添加剂有限公司产品；乙腈、四氢呋喃：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司产品。

DH-700型油浴锅：常州普天仪器制造公司产品；HH4恒温水浴锅：江苏金坛市荣华仪器有限公司产品；SD-250A型恒温培养箱：南京实验仪器厂产品；冰箱；KJ-300超声波发生器：无锡浩洁超声电子设备有限公司产品；UV-2012PCS紫外可见风光光度计：UNICO中国有限公司产品；Waters2695高效液相色谱仪：Waters公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 番茄红素微乳液的制备 称取番茄红素粉末（90%）加入中链甘油三酸酯中在一定的温度下加热溶解一段时间，接着加入吐温和乙二醇乳化，乳化完成后加入蒸馏水，得到水溶性番茄红素乳液。

1.2.2 番茄红素微乳液中番茄红素的提取 量取2 mL番茄红素微乳液加入10 mL蒸馏水稀释，加入乙酸乙酯进行3次萃取，萃取过程在80℃的水浴中进行，乙酸乙酯提取液用无水硫酸钠进行脱水，过滤，得番茄红素提取液，并用乙酸乙酯定容至100 mL。用微孔过滤膜（0.45 μm）进行过滤，所得滤液在4℃冰箱保藏备用。以上所有操作尽量避光。

1.2.3 番茄红素微乳液在不同条件下的储藏 取一定量的番茄红素微乳液装瓶并用锡箔纸包装，充氮气封口。然后分别置于入4、25、37℃的条件下进行贮藏，在贮藏过程中定期取样检测微乳液中番茄红素的变化。

1.2.4 紫外-可见光谱鉴定微乳液中番茄红素结构的变化 用紫外可见分光光度计对番茄红素微乳液中的番茄红素乙酸乙酯提取液进行UV-Vis光谱扫描，并与全反式番茄红素的乙酸乙酯溶液的UVVis光谱扫描光谱图比较，通过观察两者之间的区别，确定番茄红素微乳液中是否存在顺式结构的番茄红素。

1.2.5 HPLC分离番茄红素乳液中不同结构的番茄红素 色谱柱：COSMOSIL Cholester柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈与四氢呋喃的体积分数梯度洗脱，乙腈在60 min内由体积分数100%减小到90%，60～80 min内乙腈维持90%；流量为1 mL/min；检测波长为472 nm；柱温25℃；进样量为10 μL；二极管阵列检测器。

1.2.6 番茄红素各HPLC图谱峰的鉴定 用高效液相色谱对不同结构的番茄红素异构体进行分离并用二极管阵列检测器对每一个图谱峰进行紫外-可见光谱扫描，通过各色谱峰的全波长扫描图、主要吸收峰的波长和Q值 （Q值即为在362 nm处的吸收强度与最大吸收峰吸收强度的比值）来鉴定番茄红素属于那种构型。

1.2.7 番茄红素标准曲线的绘制 准确称取质量分数为90%的番茄红素粉末22.22 mg溶解于100 mL乙酸乙酯中，配制成20 mg/dL的番茄红素乙酸乙酯溶液，再将此溶液分别配制成番茄红素质量浓度 分 别 为 2、4、6、8、10 mg/dL 系 列 标 准 溶 液 ， 用HPLC测定各溶液的峰面积。以标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，绘制番茄红素标准曲线，得到线性方程为：Y=2 895 510x+414 430（R2=0.999 5）。

2 结果与讨论

2.1 番茄红素在微乳液制备过程中的氧化和异构化

2.1.1 紫外-可见光谱鉴定番茄红素顺式异构体对比全反式番茄红素乙酸乙酯溶液全波长扫描图（图1）与番茄红素微乳液中番茄红素乙酸乙酯提取液的全波长扫描图（图2）可知，两个全波长扫描图中番茄红素分别在447、473、503 nm处有3个最大吸收波长；但是番茄红素微乳液中的番茄红素的特征吸收光谱发生变化，在近紫外区（361 nm）处出现了特征吸收峰，此波长的特征吸收是由于反式番茄红素异构化为顺式异构体而引起的，因此可以初步确定番茄红素微乳液在加工过程中番茄红素的结构发生的变化。

图1 全反式番茄红素紫外-可见光谱图Fig.1 UV-Visible spectrum of all-trans lycopene

图2 番茄红素微乳液中番茄红素紫外-可见光谱图Fig.2 UV-Visible spectrum of lycopene in lycopene microemulsion

2.1.2 HPLC分离并鉴定番茄红素顺式异构体 从图3中的HPLC图谱峰中可以看到，全反式的番茄红素经HPLC分离出现了一个单一的色谱峰，且其在此液相条件下的保留时间（Rt）为57.13 min，从此色谱峰的UV-Vis光谱可知全反式番茄红素3个最大吸收峰分别为447、473、505 nm。由于全反式番茄红素不稳定，因此在加工的过程中容易发生了氧化降解和异构化；从图4中可以看到，经加过处理所得番茄红素微乳液中的番茄红素经液相色谱分离得到了7个色谱峰，由这7个色谱峰及每个色谱峰的UV-Vis光谱可知，保留时间（Rt）为56.55 min所对应的成分与图3中全反式番茄红素的保留时间基本一致（Rt=57.13 min），并且其UV-Vis光谱与图3中全反式番茄红素UV-Vis光谱完全一致 （最大吸收分别为447、473、505 nm），因此可以认定此成分为全反式番茄红素。

图4 番茄红素乳液中不同结构番茄红素的HPLC色谱峰与依次相应的UV-Vis光谱图Fig.4 HPLC chromatogram （a）and the UV-Vis spectrum （b～h）of different lycopene in lycopene microemulsion

其中，色谱峰上保留时间（Rt=48.8、Rt=51.15、Rt=53.78、Rt=61.07 min）对应的成分的UV-Vis光谱与全反式番茄红素的UV-Vis光谱类似，但是它们都在361 nm处出现了一个较强的特征吸收峰，且主要吸收峰的峰高也略微降低，并向紫外区转移4～12 nm。这些变化与番茄红素顺式异构体的UVVis光谱一致，可以认定这4中成分为4种不同构型的番茄红素顺式异构体。

另外，保留时间（Rt=44.6 min，Rt=46.68 min）对应成分的UV-Vis光谱图与全反式番茄红素的UVVis光谱相比有明显的变化，两者都有5个最大特征吸收峰，且其最大吸收峰较全反式番茄红素紫移30 nm左右 ，这些变化与番茄红素氧化产物和裂解产物的UV-Vis光谱相似，Ferreira[10]的研究中番茄红素氧化产物的UV-Vis光谱中特征吸收峰出现在400、420、450 nm，因此可以初步推断两者为番茄红素氧化产物或裂解产物，其具体结构的鉴定尚待进一步的研究。

表1 番茄红素乳液中不同构型番茄红素HPLC色谱峰的鉴定Table 1 Identification of HPLC chromatogram of different lycopene in lycopene microemulsion

通过表1中的实验数据和文献报道数据的对比，可以确定番茄红素微乳液中几种不同构型番茄红素异构体：R=53.78 min为 9-cis，R=56.55 min为all-trans，R=61.07 min 为 13-cis；另外，R=48.80 min为X1-cis，R=51.15 min为X2-cis。其中一些实验数据和文献报道数据略有差异，分析其主要原因是不同的文献中采用不同的流动相和色谱条件所致。

2.1.3 番茄红素乳液中各种不同构型番茄红素异构体的质量分数 由于分子中含有13个双键，全反式番茄红素在热处理过程中非常不稳定。在番茄红素微乳液在制备过程中，全反式番茄红素经油中的高温溶解、高温乳化后发生了明显的异构化，从表2的数据可知，与处理前的番茄红素粉（只含全反式番茄红素）相比番茄红素微乳液中全反式番茄红素所占比例明显减少，占总番茄红素的43.99%。其中，顺式番茄红素中9-cis的含量最多，占番茄红素总量的17.96%，13-cis的含量略少于9-cis，占总量的15.65%，另外两种顺式番茄红素占比都少于10%；另外，在加工过程中产生的番茄红素氧化产物或裂解产物占总番茄红素的4.91%。

表2 番茄红素微乳液中不同构型番茄红素的质量分数Table 2 Ratio of different lycopene in lycopene microemulsion

2.2 番茄红素微乳液在不同条件下贮藏过程中番茄红素稳定性

2.2.1 番茄红素微乳液在4℃贮藏过程中番茄红素的稳定性 从图5可以看出，顺式番茄红素的总量随时间的延长逐渐减少，在前10 d贮藏过程中总顺式番茄红素下降较快，但贮藏10 d其保留率下降缓慢，贮藏40 d后，其保留率约为80%。反式番茄红素在前15 d贮藏过程中呈缓慢的下降趋势，贮藏15 d时保留率约为92.5%，贮藏15 d后其保留率呈缓慢的上升趋势，28 d时保留率最大达到93.8%，这可能是由于番茄红素微乳液中一部分顺式异构体异构化为反式番茄红素的原因，Lovric等人[14]也认为番茄红素在贮藏过程中会发生顺-反互变现象。在此条件下贮藏番茄红素总量保留率逐渐缓慢下降，40天后其保留率约为86%。

图5 在4℃贮藏过程中番茄红素总量、反式番茄红素和顺式番茄红素总量的变化Fig.5 Change of total amount of lycopene，trans lycopene and total amount of cis-lycopene during the storage at 4℃

图6 在4℃贮藏过程中各顺式番茄红素的变化Fig.6 Change of all cis-lycopene during the storage at 4℃

从图6可以看出，各顺式番茄红素的保留率在贮藏过程中都呈现下降趋势，但是不同顺式异构体保留率随贮藏时间的延长其变化存在显著的差异，其中13-顺式番茄红素的稳定性最差，贮藏40 d后其保留率约为63%。9-顺式番茄红素和X1-顺式番茄红素在此条件下贮藏稳定性相当，贮藏40 d后两者的保留率约为80%。另外，X2-顺式番茄红素的稳定性最好，在4℃下贮藏40 d后损失率仅为5%。

2.2.2 番茄红素微乳液在25℃贮藏过程中番茄红素的稳定性 从图7可以看出，在25℃下贮藏时，番茄红素总量和总顺式番茄红素的变化情况与4℃下贮藏相似，但是在此条件下贮藏两者的保留率要比4℃下低，贮藏40 d后它们的保留率分别为68.6%、47.9%，这一变化说明温度升高能够促进番茄红素的降解，许时婴等人[15]的研究中也报道温度对番茄红素粉中的番茄红素降解有促进作用。反式番茄红素在贮藏过程中的变化趋势类似于4℃下贮藏，但是与4℃下贮藏相比反式番茄红素在25℃下贮藏8 d后，由起初的缓慢下降趋势变为缓慢的上升趋势，且在15 d后保留率又开始缓慢下降。

图7 在25℃贮藏过程中番茄红素总量、反式番茄红素和顺式番茄红素总量的变化Fig.7 Changeoftotalamountoflycopene，translycopeneand totalamountofcis-lycopeneduringthestorageat25℃

图8 在25℃储藏过程中各顺式番茄红素的变化Fig.8 Change of all cis-lycopene during the storage at 25℃

从图8可知，各顺式番茄红素量在25℃下贮藏时都逐渐下降，但是由于温度升高能加速番茄红素的降解，因此它们在此条件下的氧化降解速率明显大于4℃时的氧化速率，其中13-顺式番茄红素的变化最为明显，贮藏40 d后保留率仅为12.8%，X2-顺式番茄红素保留率约为4℃贮藏的一半，9-顺式番茄红素保留率变化较小。

2.2.3 番茄红素微乳液在37℃储藏过程中番茄红素的稳定性 从图9和图10可以看出，番茄红素微乳液在37℃下贮藏时，番茄红素的变化趋势与低温贮藏的变化趋势一致，但是反式番茄红素的保留率的变化明显小于顺式番茄红素保留率的变化，这就说明温度对顺式番茄红素的影响大于反式番茄红素。另外，温度变化对不同结构顺式番茄红素降解的影响不同，其中13-顺式番茄红素在37℃下贮藏起初阶段降解非常明显，10后其保留率小于10%，但是在接下来的贮藏过程中其降解速率非常缓慢，贮藏40 d后保留率仍约为4.5%。其余几种顺式番茄红素都逐渐降解。

图9 在37℃储藏过程中番茄红素总量、反式番茄红素和顺式番茄红素总量的变化Fig.9 Change of total amount of lycopene，trans lycopene and total amount of cis-lycopene during the storage at 37℃

图10 在37℃储藏过程中各顺式番茄红素的变化Fig.10 Change of all cis-lycopene during the storage at 37℃

3 结语

1）在番茄红素微乳液在制备过程中全反式的番茄红素能异构化为4种不同结构的顺式番茄红素， 它们分别为：x1-cis、x2-cis、9-cis 和 13-cis，且在番茄红素微乳液中的质量分数分别为：7.85%、9.64%、17.96%和15.65%。

2）番茄红素微乳液在4℃下贮藏时，总顺式番茄红素保留率随贮藏时间的延长逐渐下降，贮藏40 d后其保留率约为80%。反式番茄红素的保留率在前15 d贮藏过程中呈缓慢的下降趋势，15 d之后其保留率呈缓慢的上升趋势，28 d时保留率最大达到93.8%，这可能是由于一部分顺式番茄红素异构化为反式番茄红素，随后其保留率缓慢下降，40 d后保留率为93%。随着贮藏温度的升高番茄红素的稳定性逐渐降低，在25℃下贮藏40 d后总顺式番茄红素和反式番茄红素保留率分别为47.9%、88.1%，在37℃下贮藏40 d后总顺式番茄红素和反式番茄红素保留率分别为21.2%、76.4%，这说明温度能促进番茄红素的降解。

3）番茄红素微乳液的各种番茄红素异构体中反式番茄红素最为稳定，9-cis次之，13-cis非常不稳定，在37℃下贮藏10 d其保留率小于10%。

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