响应面法优化水飞蓟粕固态发酵培养基的研究

李 峰， 张 敏， 邹艳敏， 李 芳，朱伯乐， 赵 婷， 吴向阳， 仰榴青*

（1.江苏大学 药学院，江苏 镇江 212013；2.江苏大学 化学化工学院，江苏 镇江 212013；3.江苏大学 环境学院，江苏 镇江 212013）

水飞蓟（Sliybum maruianum （L.）Gaertn.）又名水飞雉、乳雉子，一至两年生草本植物[1-2]。其有效成分水飞蓟素具有清除自由基、抗脂质过氧化、抗肝纤维化、抗肿瘤和降血脂等生理活性[3]。近年来，随着水飞蓟素需求量的增加，水飞蓟粕残渣也随之增多。水飞蓟粕主要由蛋白质、粗纤维、多酚和黄酮类化合物等组成[4]，其中蛋白质质量分数为22%～25%[5]。但目前一般作为废物丢弃，既浪费资源，又污染环境。如水飞蓟粕直接作为动物饲料使用，存在消化性和适口性差的问题。因此，作者采用霉菌和酵母菌组成的混菌剂对水飞蓟粕进行固态发酵，并优化固态发酵培养基组成，以期得到蛋白质含量高、适口性好的生物蛋白饲料，为水飞蓟粕的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

水飞蓟粕：江苏中兴药业有限公司；麸皮、玉米粉：市售 （所有原料粉碎后过40目筛）；黑曲霉40226（Aspergillus niger）和热带假丝酵母 1254（Candida tropicalis）：中国工业微生物菌种保藏中心提供；斜面培养基：黑曲霉：马铃薯葡萄糖琼脂培养基；热带假丝酵母：麦芽汁琼脂培养基；液体种子培养基：黑曲霉：沙氏葡萄糖液体培养基；热带假丝酵母：麦芽汁培养基。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化 将菌种接种于斜面培养基上，28℃培养72 h，置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 液体种子培养 用接种环从真菌斜面取孢子一环，接入装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，120 r/min、28℃震荡培养48 h。

1.2.3 固态发酵 固态发酵培养基混合均匀，接种培养基干重10%的黑曲霉和热带假丝酵母混菌剂，调节含水量为60%，28℃培养72 h，45℃烘干，测定粗蛋白质质量分数。

1.3 单因素试验[6]

1.3.1 物料组成对混菌固态发酵的影响 以粗蛋白质质量分数为指标，分别考察了不同物料组成对混菌固态发酵的影响。其中水飞蓟粕∶麸皮∶玉米粉（质量比）分别选取 5∶3∶2、6∶3∶1、7∶2∶1、8∶1.5∶0.5、9∶0.5∶0.5 5 个水平。

1.3.2 碳源及其添加量对固态发酵的影响 在固态发酵基础培养基中加入不同碳源，考察碳源对固态发酵的影响。其中，碳源分别为葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，添加量均为质量分数0%、0.5%、1%、2%、3%。

1.3.3 无机氮源及其添加量对固态发酵的影响在固态发酵基础培养基中加入不同氮源，考察氮源对固态发酵的影响。其中，氮源分别为尿素、硝酸铵和硫酸铵，添加量均为质量分数0%、1%、1.5%、2%、2.5%。

1.3.4 无机盐及其添加量对固态发酵的影响 在固态发酵基础培养基中加入不同无机盐，考察无机盐对固态发酵的影响。其中，无机盐为磷酸二氢钾、氯化钙和硫酸镁，添加量均为质量分数0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%。

1.4 响应面设计

根据单因素试验结果和Box-Behnken中心组合设计原理，选取葡萄糖、尿素和磷酸二氢钾3个对粗蛋白质质量分数影响较大的因素为自变量，以发酵后产品粗蛋白含量为响应值，设计3因素3水平的响应面分析试验，对固态发酵营养因子进行优化；并进行验证试验，每次设3个平行。试验因素与水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Coded levels and factors of response surface analysis

1.5 分析方法

粗蛋白质质量分数测定：粗蛋白质测定采用半微量凯氏定氮法，参照国标GB/T 6432-94饲料中粗蛋白质测定方法，用于比较发酵前后的蛋白质氮量；粗蛋白质体外消化率测定：粗蛋白质体外消化率测定参照王卫国等[8]的方法。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 物料组成 由图1可知，当固态发酵培养基中含水飞蓟粕比例为80%时，蛋白质提高量相对较高，水飞蓟粕所占比例少发酵基质粗蛋白质质量分数低，随着发酵基质中水飞蓟粕比例的升高，发酵样品粗蛋白质质量分数增大，但超过90%后反而下降，这可能是由于水飞蓟粕含量过多，培养基过于黏稠，不利于溶氧和传质，影响菌体生长和产酶，导致发酵产品粗蛋白质质量分数降低。最终选定固态发酵培养基中基础物料水飞蓟粕：麸皮：玉米粉（质量比）为 8∶1.5∶0.5。

图1 不同原辅料配比对粗蛋白质质量分数的影响Fig.1 Effects of different ratio of raw and auxiliary materials on crude protein content

2.1.2 碳源及其添加量对固态发酵的影响 碳源是微生物的重要营养物质，其主要作用是构成微生物细胞的碳架和供给微生物生长繁殖所需的能源。由图2可知，3种碳源对水飞蓟粕粗蛋白质质量分数均有提高，其中葡萄糖为碳源时，粗蛋白质提高量高于蔗糖和麦芽糖，且葡萄糖添加质量分数为1%时，发酵产品粗蛋白质质量分数提高最多。最终选择葡萄糖作为固态发酵培养基的外加碳源。

2.1.3 无机氮源及其添加量对固态发酵的影响由图3可知，3种氮源对水飞蓟粕粗蛋白质质量分数均有提高，其中，尿素为氮源时，发酵产品粗蛋白质质量分数提高程度优于硝酸铵和硫酸铵，且尿素添加质量分数为1.5%时，发酵产品粗蛋白质质量分数提高最大。再增加尿素含量，粗蛋白质质量分数略有减少，这是因为尿素为非蛋白氮，相对分子质量较小，溶液渗透压较高，含量过高时抑制菌体生长，影响粗蛋白质质量分数的增加。最终选择尿素作为固态发酵培养基的外加氮源。

图2 不同碳源对粗蛋白质质量分数的影响Fig.2 Effects of different carbon resources on crude protein content

图3 不同氮源对粗蛋白质质量分数的影响Fig.3 Effects of different nitrogen resources on crude protein content

2.1.4 无机盐及其添加量对固态发酵的影响 无机盐是微生物生长繁殖必不可少的营养物质，是发酵过程中的生长刺激因子，对菌体的生长具有重要意义。由图4可知，3种无机盐对发酵产品粗蛋白质质量分数均有所提高，其中磷酸二氢钾的促进作用最明显，且添加质量分数为0.6%时，粗蛋白质质量分数最大。最终选择磷酸二氢钾作为固态发酵培养基的外加无机盐。

2.2 响应面分析

根据3因素3水平的响应面试验设计，共设有17个试验点，其中12个为析因点，5个为零点以估计误差。试验设计和结果见表2。

图4 不同无机盐对粗蛋白质质量分数的影响Fig.4 Effects of different inorganic salt resources on crude protein content

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

根据试验结果，利用Design Expert 7.0软件对试验数据（表2）进行回归拟合，得到多项式响应面回归模型：

对所得模型进行方差分析，结果见表3。由表3可知，总模型P＜0.000 1，表明该模型高度显著，失拟项不显著（P=0.595 6＞0.05），表明模型选择正确。相关系数R2=0.984 1，表明预测值与实测值之间具有较好的相关性，校正相关系数R2Adj=0.963 6，说明响应面96.36%的变化可以由此模型解释，拟合程度较好，实验误差小，可用来分析和预测固态发酵培养基最佳营养因子水平。而且，由表3中所测系数及对应的P值表明，方程的一次项显著，其中X1、X2项极显著；二次项极显著，其中X12、X22项极显著，X32项显著；交互项中除X1和X2交互作用不显著外，其他交互项的影响也是显著的，说明因素之间的交互作用很明显，因此可以用此回归方程代替各组试验对试验结果进行分析。

表3 回归方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the response surface quadratic model

利用Design Expert7.0软件对回归模型进行响应面分析得到各响应面3D分析图，见图5。从图5可以看出，各因素对提高水飞蓟粕粗蛋白含量的影响顺序为：葡萄糖（X1）＞尿素（X2）＞磷酸二氢钾（X3），其中磷酸二氢钾对试验影响不显著。通过对模型的拟合分析以及单因素试验结果，预测出最佳培养基组成为：水飞蓟粕∶麸皮∶玉米粉（质量比）为 8∶1.5∶0.5，添加质量分数1.11%葡萄糖、1.40%尿素和0.56%磷酸二氢钾。响应面模型在此条件下预测的发酵产物粗蛋白质质量分数为38.70%。

图5 葡萄糖（X1）、尿素（X2）和磷酸二氢钾（X3）对粗蛋白质质量分数影响的响应面分析图Fig.5 Response surface plot for the effects of glucose（X1），urea （X2）and potassium dihydrogen phosphate（X3）on crude protein content

2.3 验证试验

按照响应面优化得到的最佳培养基条件，进行验证试验，所得发酵后水飞蓟粕粗蛋白质质量分数为38.43%，与理论预测值相差0.27%，说明该模型能较好地预测发酵情况。

2.4 体外消化率测定

样品中蛋白质的体外消化率采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步消化法测定，发酵后水飞蓟粕粗蛋白体外消化率为88.92%，较未发酵水飞蓟粕粗蛋白体外消化率（70.12%）有显著提高，说明水飞蓟粕蛋白质在发酵过程中被水解为小分子蛋白或多肽，甚至氨基酸，更易被消化吸收，因而营养价值得到提高。顾赛红等[9]利用黑曲霉PES固态发酵使棉籽粕粗蛋白体外消化率提高13.11%。该结果与文献报道一致，混菌固态发酵能够明显的提高水飞蓟粕蛋白质的体外消化率。

3 结语

固态发酵培养基的最佳组成：水飞蓟粕∶麸皮∶玉米粉（质量比）为 8∶1.5∶0.5，添加质量分数 1.11%葡萄糖、1.4%尿素和0.56%磷酸二氢钾，发酵水飞蓟粕粗蛋白质质量分数和体外消化率分别可达38.43%和88.92%。该工艺稳定可行，为水飞蓟粕固态发酵生产蛋白质饲料提供了一定的理论依据。

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