十二碳二元酸菌种发酵工艺优化

任勇 张会萍 张萍 牛春

收稿日期：2022-10-16

作者简介：任勇，工程师，主要从事微生物菌种选育工作。

*通信作者：牛春，助理工程师，主要从事微生物菌种选育工作。

摘要：目的 以热带假丝酵母菌为试验菌株，通过发酵工艺优化，提高菌种发酵产酸量。方法 对发酵培养基中碳源和氮源等成分进行优化，同时研究了种龄、发酵培养温度、摇瓶转速、发酵接种量、发酵瓶装量和发酵pH值对发酵产酸量的影响。结果 发酵培养最适碳源为2 g/L蔗糖，最适氮源为3 g/L酵母浸膏，菌体发酵在28 ℃，200 r/min，25 mL/250 mL装量，以15%接种量条件下培养，发酵pH值调至7.0～7.5时，十二碳二元酸平均产量可达到130 g/L。结论 对发酵培养基碳氮源成分进行优化、发酵工艺进行优化，发酵产酸量提高至130 g/L。同时发酵培养基中添加氯化钠和硫酸镁后，均不利于菌种产酸。

关键词：热带假丝酵母菌；碳源；氮源；十二碳二元酸；优化；产酸量

中图分类号：R978.1         文献标志码：A         文章编号：1001-8751（2024）02-0109-06

Optimization of Fermentation Process of Dodecarbon Acid bacteria strains

Ren Yong，   Zhang Hui-ping，   Zhang Ping，   Niu Chun

（Ningxia Tairui Pharmaceutical Co.， LTD.，   Yinchuan   750100）

Abstract： Objective To improve the acid production of Candida tropicalis by optimizing the fermentation process. Methods The effects of seed age， fermentation culture temperature， shake flask rotation speed， inoculation volume， filling volume， and sources for the 2 g/L of sucrose， the ideal nitrogen source for 3 g/L extract yeast， bacteria fermentation at 28 ℃， and fermentation pH value on acid production were also studied. The carbon source， nitrogen source， and other components in the fermentation medium were optimized. Results Fermentation to develop the optimal carbon 200 r/min， 25 mL/250 mL bottle， with a 15% seed volume， under the condition of fermentation pH value to 7.0～7.5， the average yield of dodecarbonate can reach 130 g/L. Conclusion The carbon and nitrogen supply components of the fermentation medium were improved， along with the fermentation process， resulting in an increase in the fermentation acid production to 130 g/L. At the same time， The addition of sodium chloride and magnesium sulfate in the fermentation medium is not conducive to the production of acid by the strains.

Key words： Candida tropicalis;   carbon source;   nitrogen source;   dodecarbonate;   optimize;   acid production of the strain

长链二元酸，化学式为HOOC（CH2）nCOOH （n≥7） ，是指碳链中含有10 个以上碳原子的直链脂肪族二元羧酸。是一种重要的精细化工原料，可以合成特种尼龙、高级香料、高档尼龙热熔胶、高级润滑油、高级油漆、高级涂料和耐寒性增塑料等高附加值的特殊工业化学品种，也可以合成医药和农药等[1-3]，用途广泛。目前，未见天然10个碳原子以上的二元酸的报道，多数通过人工合成获取，其中化学合成法生产条件苛刻，工艺复杂，不环保，相比下微生物发酵法发展前景广阔，工业生产价值更高[4-5]。

十二碳二元酸（DC12）是长链二元酸的一种，可由烷烃直接发酵获取，以正构烷烃为原料，利用热带假丝酵母菌的氧化性能，在常温常压下氧化正构烷烃两端的甲基，生成基质烷烃相应链长的二元酸[6-8]。但在大规模的工业生产过程中，存在正构烷烃转化率低，生产成本高等问题，本文从发酵培养基的碳源、氮源等营养成分，发酵培养温度、摇瓶转速、接种量和发酵瓶装量等方面进行优化，以期为进一步提高菌种产十二碳二元酸的能力提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

热带假丝酵母（Candida tropicalis）RRY-1，由宁夏泰瑞制药有限公司菌种保藏室保藏。

1.1.2 仪器与试剂

紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司），立式摇床（乐山长征制药机械有限公司），电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），酸度计（上海精密科学仪器有限公司），酸碱滴定管，正十二碳烷烃（纯度≥98%，麦克林试剂）。

1.1.3 培养基

斜面培养基：麦芽汁10Be，琼脂2%。

种瓶培养基：蔗糖5 g/L，酵母浸膏3 g/L，玉米粉1 g/L，尿素3 g/L，正十二烷烃86 g/L，磷酸氢二钠7 g/L。

发酵培养基：酵母浸膏3 g/L，尿素3 g/L，正十二烷烃175 g/L，磷酸氢二钠6 g/L，蔗糖2 g/L。

1.1.4 培养条件

斜面培养：将保藏菌种取一接种环于固体麦芽汁培养基中，28 ℃培养48 h。

种瓶培养：将培养好的斜面取一环接种于液体培养基中，于28 ℃，200 r/min培养48 h。

发酵培养：以15%～20%接种量将种子液接种于装有25 mL发酵培养基的250 mL的三角瓶中，发酵在28 ℃，200  r/min培养144 h，检测十二碳二元酸含量。

1.2 分析方法

1.2.1 菌体浓度（OD）的测定

取1 mL培养液，加蒸馏水稀释30倍，混匀，吸取2 mL混匀液加入4 mL溶媒溶剂（氯仿∶乙醇∶正丁醇体积比为1∶10∶10），以溶媒溶剂作为空白对照，在620 nm波长下测定菌体浓度（OD）值。

1.2.2 十二碳二元酸的提取与测定

发酵结束后，取适量发酵液沸水中加热，用浓碱调pH至10～11，高速离心，去除上层烷烃和乳化物质，同时弃去底部沉淀，剩余发酵液用浓酸调节pH至2左右，溶液中十二碳二元酸以白色晶体形式析出，高速离心分离出沉淀固体。用25 mL95%的中性乙醇溶解白色固体，加入两滴酚酞，用标准氢氧化钠溶液滴定，记录消耗的氢氧化钠体积，计算十二碳二元酸含量[9-10]。

十二碳二元酸产量（g/L）=MNV1/V2

式中：M表示十二碳二元酸的分子质量（g/mol），N表示标准氢氧化钠浓度（mol/L），V1表示消耗氢氧化钠的体积（mL），V2表示发酵液体积（mL）。

2 实验

2.1 种龄对发酵产酸量的影响

不同培养周期的菌种成熟程度不同，对菌种的形态及代谢有很大的影响，选择最适的种龄转接发酵瓶，最大发挥菌种的生产能力。实验过程中种瓶在28 ℃条件下分别培养12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，发酵培养条件不变，测定二元酸含量。

2.2 不同碳源对发酵产酸量的影响

微生物对各种碳源的需求不一样，利用碳源时需要产生不同的酶来催化反应，同时不同碳源的利用速度对发酵产酸量也有着很大影响，所以发酵培养基碳源的优化意义很大。实验选用蔗糖、葡萄糖和麦芽糖作为发酵培养基本碳源，发酵瓶在28 ℃，200  r/min培养144 h，发酵结束后，检测不同碳源培养基中二元酸的含量。

2.3 不同氮源对发酵产酸量的影响

本实验选用酵母浸膏、酵母浸粉、酵母粉、玉米浆、蛋白胨、尿素和硫酸铵作为发酵培养基本氮源，发酵瓶在28 ℃，200  r/min培养144 h，发酵结束后，检测不同氮源培养基中二元酸的含量。

2.4 不同培养温度对发酵产酸量的影响

发酵瓶在其他培养条件不变情况下，分别在25 ℃、28 ℃、30 ℃和32 ℃下培养，发酵结束后，测定十二碳二元酸的含量。

2.5 不同摇瓶转速对发酵产酸量的影响

在发酵培养条件不变情况下，发酵瓶分别在180  r/min、200  r/min、220  r/min和240  r/min的摇床培养，发酵结束后，测定十二碳二元酸的含量确定最佳摇瓶转速。

2.6 不同接种量对发酵产酸量的影响

种子液培养到对数生长期后，以5%、10%、15%和20%的接种量转入发酵瓶中，其他培养条件不变，发酵结束后，测定十二碳二元酸的含量确定发酵最佳接种量。

2.7 不同装量对发酵产酸量的影响

在适宜的条件下，发酵瓶分别装量15mL、20 mL、25 mL、30 mL、35 mL和40 mL，以15%的接种量转入种子液，发酵结束后，测定十二碳二元酸的含量确定发酵瓶最佳装量。

2.8 发酵pH值对发酵产酸量的影响

发酵液过程中pH值对代谢产物的转化影响至关重要。合适的pH值会促进酶的活性，加速菌体转化烷烃的速率。查阅相关论文[4]，发酵pH值酸性条件下不适合十二碳二元酸的转化，pH值偏碱性会大量提高十二碳二元酸的合成，本实验在发酵转化烷烃时每隔24 h调节发酵液到指定pH值，考察pH值对菌体产酸量的影响。

2.9 无机盐对发酵产酸量的影响

无机盐在发酵过程中有着重要作用，可以提供给微生物必要的营养和维持适宜的环境条件，本文在发酵培养基中分别添加氯化钠和硫酸镁两种无机盐，希望对提高二元酸的产量提供参考。

3 结果与分析

3.1 种龄对发酵产酸量的影响

如表1所示，种瓶分别培养12 h、36 h、48 h、60 h和72 h，测定发酵瓶产酸量，前期种龄延长发酵产酸量增大，种龄在48 h时，发酵产酸量最大，随着种瓶继续培养，发酵产酸量减少。种瓶培养时间过长，菌体数量增大，但菌体容易老化，转入发酵瓶出现自溶现象，不利于发酵产量的提高，由表提示，种龄48 h时发酵产酸量最大。

3.2 不同碳源对发酵产酸量的影响

如图1所示，选用的三种碳源都可以被利用，其中蔗糖作为发酵基本碳源，发酵产酸量最高，然后是麦芽糖，最后是葡萄糖，检测OD值蔗糖和麦芽糖OD值较高，葡萄糖次之。蔗糖与麦芽糖产酸量差别较小，两者都是双糖，在发酵产酸期延长时，可以为菌体发酵持续提供能量，而葡萄糖容易被利用，不能满足于菌体产酸的要求，所以发酵培养基中选用蔗糖作为碳源。

3.3 碳源浓度对发酵产酸的影响

发酵培养基中添加蔗糖对发酵产酸量有着明显的提高，分别用1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L和5 g/L五个浓度的蔗糖作为碳源，其他条件不变，发酵培养144 h 。结果如图2所示，发酵产酸量随着蔗糖浓度的增大先增大后降低，蔗糖浓度在2 g/L时发酵产酸量最大，发酵OD值也是先增大后降低。随着蔗糖浓度的加大，增大了发酵培养基的黏度，减小了发酵溶氧量，从而影响菌种氧化烷烃的能力，所以，蔗糖添加浓度为2 g/L时发酵产酸量可维持较高水平。

3.4 不同氮源对发酵产酸量的影响

如图3所示，发酵培养基中添加不同类型氮源，添加酵母类的氮源、蛋白胨等有机氮源发酵产酸量整体偏高，其中酵母浸膏可以明显提高发酵产酸量，酵母类氮源富含蛋白质、氨基酸、肽、多肽、核酸、维生素及微量元素等营养成分，可促进菌体生长。添加尿素发酵产酸量次之，添加无机氮源硫酸铵后，摇瓶效价偏低未有明显提高，硫酸铵在代谢过程中剩下酸根离子会对发酵pH值产生影响，从而影响发酵产酸水平。发酵使用玉米浆后，摇瓶效价低，玉米浆含糖量高，发酵过程中产生大量酸性物质，利于菌体大量生长，但不利于菌体转化烷烃生成产物。发酵最佳氮源选用酵母浸膏。

3.5 氮源浓度对发酵产酸量的影响

分别用1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L和6 g/L六个浓度的酵母浸膏作为氮源，其他条件不变，发酵培养144 h。如图4所示，发酵产酸量随着酵母浸膏浓度的增大先增大后降低，发酵OD值也是先增加后降低，所以酵母浸膏浓度为3g/L时对发酵产酸有着促进作用。

3.6 不同培养温度对发酵产酸量的影响

如图5所示，28 ℃培养发酵瓶，发酵产酸量最大，随着发酵培养温度升高，菌体产酸水平降低，32 ℃时菌体产酸量和OD值明显降低。培养温度影响菌体的生长速度，培养基的蒸发量及产物的形成，培养温度过高会影响菌体代谢相关酶的活性，甚至导致酶的失活。由图可知热带假丝酵母菌在25～32 ℃都可生长，但当温度超过32 ℃时，菌体发酵产酸量明显降低，生物量也明显降低，超过32 ℃不适合发酵培养菌种，所以菌体最适培养温度为28℃。

3.7 不同摇瓶转速对发酵产酸量的影响

如图6所示，发酵摇瓶转速为200 r/min时，发酵产酸量最大。在发酵摇瓶中，一定发酵体积下提高摇瓶转速，可以加快菌种的生长速度，溶氧量也增大，但过高的转速会形成剪切力，对细胞的结构造成破坏，进而抑制菌体的生长。实验结果显示，摇瓶转速在200  r/min、220  r/min、240  r/min时，发酵产酸量相差不大，低转速会更节约成本，确定发酵摇瓶转速为200  r/min。

3.8 不同接种量对发酵产酸量的影响

如图7所示，随着发酵接种量的增大，发酵产酸量是先增加后降低，OD值先增加后降低，接种量为15%时发酵产酸量最大，接种量增大到20%发酵产酸量开始降低，主要因为菌体接种量大，延滞期短，前期发酵速度快，但随着后期发酵周期延长，发酵培养基中营养物质基本耗完，发酵速度降低从而影响发酵产酸水平。发酵接种量为15%，发酵培养144 h时产酸量最大。

3.9 不同装量对发酵产酸量的影响

如图8所示，随着发酵瓶装量的增大，发酵摇瓶的产酸水平整体呈降低的趋势，OD值逐渐降低，发酵装量25 mL时产酸量最大。发酵装量越少，发酵液接触空气的面积越大，通气量越大，发酵体积超过30 mL后，发酵产酸量明显降低，热带假丝酵母菌为好氧菌，确定发酵最佳装量为25 mL。

3.10 发酵pH值对发酵产酸量的影响

如图9所示，发酵过程中调节发酵液pH值，发酵pH值在4.0～5.0时，发酵产酸量极低，调节pH值在5.5以后，发酵产酸量开始大量累积，发酵pH值在7.0～7.5时，二元酸含量达到最大值。当发酵pH偏低时，发酵液中存在过多H+，细胞内二元酸无法快速转运到胞外，抑制二元酸的转化速率。当发酵液pH调至碱性时，胞外OH-中和H+，加速了细胞内产物的转运，同时碱性条件可以加快产物形成盐，减少产物对酵母细胞的毒害作用，从而提高产物的累积。当发酵pH值调节至8.0以后，二元酸产量开始减少，由于发酵pH值过高，对细胞内酶的活性有一定影响，使菌种代谢的速率减慢。在发酵过程中，发酵pH值调节在7.0～7.5时，有利于二元酸的转化。

3.11 无机盐对发酵产酸量的影响

如图10所示，在发酵培养基中分别添加不同浓度的氯化钠和硫酸镁，经摇瓶验证，发酵培养基中添加氯化钠和硫酸镁后，二元酸的产酸量出现不同程度的降低，氯化钠和硫酸镁均不利于菌种发酵产酸。钠离子可维持发酵液的离子平衡，保持适宜的渗透压，但发酵培养基中添加氯化钠后，菌种产酸量开始降低，可能发酵培养基中已经有磷酸氢二钠，有足够的钠离子维持渗透平衡，再添加氯化钠造成了细胞外部渗透压高，不利于产物二元酸运出细胞，抑制了代谢速率。镁离子可促进细胞内酶的活性，但添加不同浓度硫酸镁后，二元酸的产酸量逐渐降低，说明镁离子没有起到促进细胞转化二元酸的生成，硫酸镁不适合添加到发酵培养基中。

4 讨论

目前国内主要通过发酵法生产长链二元酸，由热带假丝酵母菌转化正构烷烃获得相应碳数的二元酸[4]，工业生产中主要选用：（1）选育优势菌株；（2）优化培养基成分和优化发酵工艺；（3）长链二元酸分离提取工艺的改进与优化，通过上述三种方法来提高发酵产酸水平[4]。赵意平[7]通过对十二碳二元酸培养基碳源和氮源优化，发现菌体产酸培养基用2.0%蔗糖和0.5%葡萄糖的复合碳源比单一蔗糖产酸高14.5%；丁海燕等[11]研究发现菌体发酵适宜的氮源为2 g/L酵母膏和2 g/L尿素。本文以热带假丝酵母菌为试验菌株，主要进行菌种发酵培养基的碳源和氮源优化，确定了发酵培养基最适碳源为2 g/L蔗糖，最适氮源为3 g/L酵母浸膏，发酵摇瓶时菌体产酸量高且稳定。同时进行了发酵培养条件优化，确定发酵最佳培养温度为28 ℃，发酵摇瓶最佳转速为200  r/min，最适接种量为15%，发酵最佳装量为25 mL，菌种产酸能力可达到130 g/L。

长链二元酸的生长过程为非生长偶联型发酵[4]，酵母菌的增长与发酵产物的积累无关联。发酵前期大量生长菌体，后期菌体达到一定数量进行发酵产酸，菌体生长和发酵产酸所需的pH值不同，控制好pH值对产酸速率有着很大的影响。刘树臣等[12]考察得出细胞外pH对热带假丝酵母菌细胞内pH略有影响，生长碳源对细胞内pH影响明显。肖云志等[13]研究表明，发酵初期不加入烷烃，待菌浓达到一定程度之后加入足量烷烃，发酵产酸量有所提高，还可以达到缩短发酵周期的目的。本文在发酵培养过程中调节pH值，验证发酵pH值对菌体产酸的影响，研究发现菌体在酸性条件下产酸率低，调节发酵pH到7.0～7.5时，发酵产酸率达到最大值，发酵液在碱性条件更适合产物的合成。在接下来的研究中，将会对发酵底物烷烃的补料控制，溶氧控制等方面进行优化，以提高十二碳二元酸的产酸量。

参 考 文 献

陈远童. 长链二元酸的用途[J]. 微生物学通报， 2000， 27（5）： 389.

陈远童. 长链二元酸的用途[J]. 微生物学通报， 2000， 27（6）： 276.

杨晨， 宋兴福， 侯本良， 等. 长链二元酸重组分中混合二元酸提取技术进展[J]. 化工进展， 2020， 349（10）： 4134-4139.

桂秋芬， 姚嘉晏， 蒋洋松， 等.利用热带假丝酵母发酵生产长链二元酸的研究进展[J]. 化学与生物工程， 2014， 31（1）： 17-22.

李晓姝， 高大成， 乔凯， 等. 发酵法长链二元酸分离提取研究进展[J]. 石油化工， 2017， 46（9）： 1214-1218.

解丽娟， 张艳丽， 王崇晖.十三碳二元酸的精制方法[J]. 精细与专用化学品， 2002， 20： 13-15.

赵意平. 十二碳二元酸生产菌培养基碳源与氮源的优化[J]. 化学工业与工程技术， 2014， 3： 66-69.

卢利玲. 膜分离技术在长链二元酸发酵液分离中的应用[J]. 化学工业与工程技术， 2011， 32（1）： 50-52.

杜鹏. 热带假丝酵母发酵油脂产十二碳二元酸的研究[D]. 济南， 齐鲁工业大学， 2016.

彭健， 苏静， 杨晓慧， 等. 热带假丝酵母高效利用甘油研究[J]. 中国生物工程杂志， 2018， 38（2）： 38-45.

丁海燕， 何连芳， 孙玉梅，等.摇瓶发酵制取长链二元酸工艺条件的研究[J]. 河南工业大学学报（自然科学版）， 2007， 1： 75-78.

刘树臣， 谢澜漪， 李春，等. 热带假丝酵母细胞内pH的测定及其与生长代谢活性的关系[J]. 生物工程学报. 2004， 2： 279-283.

肖云智， 焦鹏， 华玉涛，等.烷烃对P450酶的诱导及二元酸发酵工艺改进[J]. 生物工程学报. 2001， 2： 218-220.