卡那链霉菌培养基碳源、氮源及微量元素优化研究

马继花 张萍 牛春 石彦鹏

收稿日期：2023-06-08

作者简介：马继花，助理工程师，主要从事抗生素发酵菌种生产、选育研究。

*通信作者：石彦鹏，检验师，主要从事微生物发酵菌种选育研究。

摘要：通过单因素及多因素实验对卡那链霉菌生长繁殖的培养基进行了优化研究。结果表明：影响卡那链霉菌生长的固体培养基主要因素有碳源的选择及培养基灭菌前pH值调节，实验确定最佳的碳源为饴糖，培养基灭菌前pH：7.50左右；影响卡那链霉菌积累代谢产物的发酵培养基主要因素有碳源的选择，微量元素的添加，实验确定结果为：最佳碳源是乳糖，其次培养基中添加0.03%FeSO4后发酵液的滤速比对照提高了65.0%，摇瓶效价比对照提高了21.97%。

关键词：卡那链霉菌；培养基；pH值；微量元素；滤速；摇瓶发酵

中图分类号：R978.1         文献标志码：A         文章编号：1001-8751（2024）02-0100-09

Optimization of Carbon and Nitrogen Sources and Trace Elements for

Streptomyces kanamyceticus Production

Ma Ji-hua，Zhang Ping，Niu Chun，Shi Yan-peng

（Ningxia Tairui Pharmaceutical Co.， Ltd.，   Yinchuan   750101）

Abstract： The growth and reproduction medium of Streptomyces kanamyceticus was optimized by a series of single-factor and multi-factor experiments. The results showed that the main factors affecting the growth of the solid medium of Streptomyces kanamyceticus were the choice of carbon source and the pH adjustment before the medium sterilization. The experiment found that caramel was the optimum carbon source， and that the pH of the medium was approximately 7.50 prior to medium sterilization. The choice of carbon source and the inclusion of trace elements are the primary factors determining the accumulation of metabolites in the Streptomyces kanamyceticus fermentation medium. The experimental results are as follows： the best carbon source is lactose， followed by the filtration of fermentation broth after adding 0.03% FeSO4 to the medium. The speed was increased by 65.0% compared with the control， and the potency of the shake flask was increased by 21.97% compared with the control.

Key words： Streptomyces kanamyceticus;   medium;   pH value;   trace elements;   filtration rate;   shake flask fermentation

卡那霉素是由卡那链霉菌产生的氨基糖苷类抗生素，是合成地贝卡星和阿贝卡星的主要原料，临床上多用于治疗败血症和重症感染等。卡那链霉菌产生卡那霉素的主要组分卡那霉素A，但制备半合成抗生素阿贝卡星和地贝卡星的关键原料是卡那霉素Ｂ，而卡那霉素Ｂ的主要来源是从生产卡那霉素Ａ的废液中分离得到。目前，由于分离工艺复杂，含量少，得来不易，难以满足工业化需求，从而大大制约了阿贝卡星与地贝卡星的开发与应用[1]。因此尝试应用微生物转化方法对卡那霉素进行结构改造，利用微生物中特定的酶将一种物质（底物）转化成为另一种物质（产物），从而得到一个结构新颖的衍生物，有望达到工业化应用需求[2]。

本文主要是以优化验证得到适合该菌种生长繁殖的固体培养基及液体培养基为目的，考察研究固体培养基的成分及菌种最适生长环境，进一步优化得到积累卡那霉素代谢产物的摇瓶发酵培养基成分及确定关键的影响因素，以摇瓶验证结果为指导可以应用到发酵罐扩大生产中，提高发酵产量。

1 材料与方法

1.1 菌种

卡那霉素链霉菌，编号CGMCC4.1441，为中国科学院普通微生物菌种保藏中心。

1.2 培养基

1.2.1 固体培养基

（1）酵母抽提物0.4 g，麦芽提取物0.4 g，葡萄糖0.4 g，燕麦片2.0 g，琼脂2.0 g，定容至100 mL，pH7.0，28.0 ℃，培养8 d（该培养基为CGMCC提供菌种扩培培养基）。

（2）牛肉膏0.3 g，蛋白胨0.5 g，氯化钠0.5 g，饴糖1.0～1.5 g，琼脂2.0 g，定容至100 mL，pH7.5，26.8～27.0 ℃，培养8 d[3]。

（3）牛肉膏0.2 g，蛋白胨0.5 g，氯化钠0.3 g，葡萄糖.5 g，琼脂2.5 g，定容至100 mL，pH7.5，27 ℃，培养5 d[4]。

1.2.2 种子培养基

（1）可溶性淀粉2.0 g，葡萄糖0.5 g，氯化钠0.4 g，豆饼粉2.5 g，硝酸钠0.5 g，碳酸钙0.1 g，定容至100 mL，pH自然[4]。

（2）可溶性淀粉1.5 g，葡萄糖0.5 g，蛋白胨0.5 g，酵母粉0.5 g，氯化钠0.05 g，硫酸铵0.05 g，磷酸氢二钾0.05 g，硫酸镁0.05 g，碳酸钙0.1 g，定容至100 mL，pH7.5，28 ℃，220 r/min，48 h[2]。

（3）可溶性淀粉2.0 g，葡萄糖0.5 g，酵母粉0.1 g，氯化钠0.4 g，豆饼粉2.0 g，玉米粉1.0 g，硝酸钠0.1 g，碳酸钙0.5 g，定容至100 mL，pH7.2～7.5，27.0～28 ℃，220 r/min，46～50 h[5]。

1.2.3 发酵培养基

（1）可溶性淀粉2.5 g，黄豆饼粉3.0 g，麦芽糖2.5 g，硝酸钠0.8 g，硫酸锌0.01 g，定容至100 mL，pH7.2，27 ℃，230～240 r/min，接种量10%，144 h[6]。

（2）可溶性淀粉4.0 g，葡萄糖0.5 g，蛋白胨0.5 g，花生饼粉2.0 g，磷酸氢二钾0.05 g，硫酸镁0.05 g，碳酸钙0.1 g，定容至100 mL，pH7.8，28 ℃，240 r/min，接种量8%，120 h[2]。

（3）可溶性淀粉6.0 g，黄豆饼粉5.0 g，硝酸钠0.8 g，硫酸锌0.02 g，葡萄糖0.5 g，麦芽粉4.0 g，定容至100 mL，pH7.2～7.5，27.0～28.0 ℃，接种量10%，120～130 h[5]。

1.3 主要仪器及试剂

电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）、酸度计（上海精密科学仪器有限公司）、离心机（上海安享科学仪器厂）、生化培养箱（上海申光仪器仪表有限公司）、摇瓶机（乐山长征制药机械有限公司）、净化工作台（无锡市百净净化科技有限公司）、紫外风光光度计（日本岛津有限公司）。试剂均为分析纯。

1.4 试验方法

1.4.1 固体培养基筛选及优化方法

通过文献查阅得到上述固体培养基配方，按照三种配方制备空白平板，用培养成熟的新鲜斜面按照10倍稀释分离法分离，观察平板上菌落生长情况，初步筛选出卡那链霉菌菌落生长较好的固体培养基配方，然后用单因素试验对培养基配方中的碳源葡萄糖、麦芽糖、乳糖、饴糖和蔗糖进行筛选，观察记录平板上菌落生长情况。

1.4.2 种子培养基筛选

对卡那链霉菌生长的不同种子培养基配方进行初步筛选，得到较适合菌丝体生长繁殖的培养基配方。

1.4.3 发酵培养基筛选及优化方法

通过对文献[2，5-6]进行检索，对产卡那霉素的不同发酵培养基配方进行初步筛选，得到较适合该菌种生长繁殖的发酵培养基配方，然后利用正交试验对初选发酵培养基配方中的物料可溶性淀粉、黄豆饼粉、麦芽糖、硝酸钠和硫酸锌进行优化，每个因素设计3个水平，按照正交试验设计选择正交表L18（37）进行试验。

1.4.4 培养方法

斜面培养：用75%的酒精脱脂棉对冻干管外表面进行消毒后，用火焰加热其顶端，滴少量无菌水至加热的冻干管顶端使之破裂，用镊子敲下破裂的顶端玻璃，加1 mL灭菌纯化水完全溶解，取适量菌悬液加到斜面培养基上均匀划线，放于26.8～27.0 ℃，培养8 d[3]。

种瓶培养：取活化的新鲜斜面挖块0.5 cm2接到装有30 mL种子培养基的300 mL三角瓶中培养，27.0～28 ℃，220 r/min，46～50 h[5]。

发酵瓶培养：按照10%的接种量（V/V）将种子液接入“1.2.3”三种不同发酵培养基中，培养基装量为300 mL三角瓶中，装培养基40 mL，27.0～28.0 ℃，接种量10%，120～130 h[5]。

1.4.5 菌体浓度测定

取10 mL发酵液，以3000 r/min，离心10 min，测量上清液体积，计算得出菌体浓度（%）=（10－上清液体积）/10×l00%。

1.4.6 效价检测方法配制

（1）卡那霉素试剂溶液配制   1.86 g/L，称取卡那霉素0.186 g，用水溶解后，定容于100 mL容量瓶中，备用。茚三酮溶液：10.00 g/L，称取茚三酮 1.00 g，用无水乙醇溶解后，定容于100 mL容量瓶中，备用。乙酸—乙酸钠缓冲溶液：分别配制0.1 mol/L 的乙酸和乙酸钠溶液，在pH计调控下，配制不同pH的缓冲溶液，备用。 卡那霉素、茚三酮、氢氧化钠、冰乙酸和无水乙醇均为分析纯，试验用水为纯化水[7]。

（2）标准曲线绘制   取10 mL烧杯8个，分别加入卡那霉素标准溶液0.40 mL，0.70 mL，1.00 mL，1.30 mL，1.60 mL，1.90 mL，2.20 mL和2.50 mL，然后依次加入乙酸一乙酸钠溶液1.00 mL，茚三酮溶液1.00 mL，按试验方法处理，以试剂空白为参比，测量其在563 nm处的吸光度[7]。

（3）摇瓶发酵液处理   取发酵液用盐酸调节pH为5.0～6.0，过滤，取稀释倍数适量的样品1.00 mL+乙酸—乙酸钠缓冲溶液1.00 mL+茚三酮溶液1.00 mL，然后沸水浴20 min，纯化水定容至25 mL，在563 nm处测量其吸光度[7]。

2 结果与分析

2.1 固体培养基初选实验

2.1.1 不同固体培养基对卡那链霉菌菌落生长的影响

选用新鲜斜面刮取0.5～1.0 cm2斜面孢子制成适宜浓度的菌悬液，按照10倍稀释分离法取10-6和10-7各0.1 mL菌悬液加入到三种分离平板上，用刮棒涂布均匀，按照相应的培养条件进行培养并观察记录。

卡那链霉菌为放线菌，菌体生长较快，孢子丰富，呈白色，因此由表1可知，固体培养基配方编号2的配方较好。但是该平板在2～8 ℃冰箱保存过程中发现随着保藏时间延长，菌落上的孢子会减少，出现自溶现象，这可能是培养基中采用葡萄糖做碳源受到影响[3]。

2.1.2 固体培养基中碳源对菌落与斜面生长的影响

固体培养基是供菌种繁殖大量孢子的培养基，对这种培养基的要求是能使菌体生长快，产孢子数最多且质量好并且不会引起菌种变异，能保持菌种优良特性，因而选择一个适合的产孢子培养基非常关键，下面对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、饴糖和D-半乳糖进行单因素实验。

从表2中观察记录的菌落形态与斜面外观看，培养卡那链霉菌的固体培养基中比较适合的碳源依次是饴糖、麦芽糖和葡萄糖。从菌落生长外观描述看，饴糖培养基上长出的菌落菌层厚，饱满结构紧密而坚硬，呈褶皱状，能产丰富的白色孢子，麦芽糖略差一些；而葡萄糖培养基上长出的菌落菌层厚、软，有少量的白色孢子，由此可确定饴糖是较适合的碳源。但是不同批号的饴糖质量不同，对斜面产孢子的影响很大。陈旧的饴糖和酸度高的饴糖效果不佳，表现为斜面气生菌丝短，不产孢子或产孢子量少，因而斜面呈灰白色，菌落光秃，结构致密，前期生长过快，后期生长缓慢，发酵单位偏低。其影响因素估计与饴糖制备工艺中微量元素以及其他维生素含量有关，陈旧饴糖由于储存时间过长，储存条件不好，温度过高引起发酵变酸，产生少量乙醇从而大大影响饴糖的质量。

2.1.3 葡萄糖、麦芽糖和饴糖斜面生产力验证

通过在固体培养基上菌落的外观观察得出饴糖营养成分更适合该菌种的生长，将三种不同碳源培养基上的菌体接摇瓶培养验证，确定最佳碳源。

如表3所示，通过摇瓶验证得出三种碳源摇瓶效价接近，结合表2中菌体外观观察结果，以葡萄糖作碳源的培养基，pH值降低速度较其他两种较快，导致卡那霉素产量低，饴糖性能不稳定，因此可用麦芽糖来替代饴糖。

2.1.4 斜面培养周期对产孢情况的影响

从表4对不同培养周期的斜面外观及斜面菌体压片观察记录的结果看，斜面培养9～10 d可得到白色、孢子量丰富的菌体斜面，因此该斜面培养周期至少培养9 d。

2.1.5 固体培养基pH对单菌落生长的影响

由于在实验过程中发现平板培养基pH不同，导致分离平板上菌落生长有较大的差异性，因此将培养基的pH按照自然pH（5.04）、5.50、6.00、6.50、7.00、7.50进行梯度验证。

由表5可知不同pH的平板培养基上菌落生长相差很大，因此可确定固体培养基pH值在7.50左右较好。

2.2 种子培养基初选实验

2.2.1 不同种子培养基对菌丝体生长的影响

种子培养基就是为了扩大菌丝体繁殖，能在短时间内获得数量多质量高的菌种，以满足发酵生产的需要，对“1.2.2”中三种不同种子培养基配方进行验证，在相同培养条件下，筛选出菌体浓度高，菌丝形态好的培养基配方即可作为卡那链霉菌生长繁殖菌丝体的配方。

由表6记录的各参数值及菌丝形态看，种子培养基配方1比较适合该菌种菌丝体扩大培养。

2.2.2 种子培养周期对生产能力的影响

用筛选得到的种子培养基配方1配制种子培养基，用发酵培养基初选得到的发酵培养基配方1作为摇瓶配方，验证最佳的种子培养周期对生产能力的影响。

由表7和图1所示，随着种子培养周期的增加种子pH和菌体浓度逐渐上升，培养48 h菌体菌浓呈下降趋势，其对应的生产能力达到最高，经验证数据分析得种子培养周期48 h最佳。

2.3 卡那链霉菌生产发酵摇瓶培养基选择

2.3.1 不同发酵培养基对卡那链霉菌摇瓶效价的影响

发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，由于发酵培养基的主要作用是为了最大限度地获得目的产物，因此必须根据菌体自身生长规律及产物合成的特点来设计培养基。下面对查阅文献[2，5-6]得到的发酵培养基配方进行摇瓶验证，以摇瓶发酵液检测的效价单位来判定比较适合卡那链霉菌菌种代谢产物积累的发酵培养基配方。

由表8可知发酵培养基配方1摇瓶验证效价较高，重复性较好，但是发酵液过滤滤速较慢，因此对初选出的培养基配方采用正交试验方法对培养基各种成分及配比进一步优化验证。

2.3.2 初选摇瓶培养基配方正交试验优化

采用正交试验对可溶性淀粉、黄豆饼粉、麦芽糖、硝酸钠和硫酸锌的配比进一步优化，选用L18（37）正交表，其正交试验设计见表9，试验结果见表10。

采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计分析。由表10可知，虽每批试验结果没有完全重复，按照培养基中原材料成分占比综合分析各因素对产卡那霉素效价的影响程度为：麦芽糖＞黄豆饼粉＞硫酸锌＞硝酸钠＞可溶性淀粉，试验最优组合为可溶性淀粉4.0 g、黄豆饼粉4.0 g、麦芽糖2.5 g、硝酸钠0.8 g和硫酸锌0.05 g。

2.3.3 发酵培养基中添加FeSO4对摇瓶效价及发酵液滤速的影响

赵静岩等[8]研究发现用发酵罐扩大生产，硫酸锌加量为0.02%效价最好，另外提出铁是菌体细胞、细胞色素氧化酶和过氧化酶的辅基，对菌丝体生长发育和形成卡那霉素来说是必需的微量元素。由于培养基组成和配比以及发酵条件不同，发酵罐和摇瓶利于提高效价的最适铁离子浓度存在很大差异。生产罐卡那霉素发酵培养液铁离子的适合浓度是50 μg/mL，下面需要对摇瓶培养基中硫酸亚铁的加量进行单因素试验。

由表11显示的摇瓶效价得知，发酵培养基中添加不同量的FeSO4后摇瓶效价比不添加FeSO4的摇瓶效价均有不同程度的提高，其中添加量以0.03%较好；其次发现添加FeSO4后发酵液的滤速比对照提高了65.0%，发酵液摇瓶效价比对照提高了21.97%。

2.3.4 发酵培养基中添加不同碳源对产卡那霉素的影响

发酵培养基中选择不同的碳源对积累代谢产物有一定的影响。选取葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、饴糖和乳糖进行优化实验。葡萄糖几乎是所有微生物都能利用的速效碳源。麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖和饴糖水解产物都可得到葡萄糖，乳糖是由葡萄糖和半乳糖组成的双糖。当发酵进入生产后期，葡萄糖降解物具有抑制N-乙酰卡那霉素酰胺水解酶合成的作用，降低卡那霉素产量。因此，发酵碳源必须以多糖为主，既利于发酵前期菌体快速生长，又能确保生产期菌体缓慢利用，提高卡那霉素产量。

从表12中数据可知，经摇瓶验证供卡那链霉菌菌种生长较好的碳源有饴糖、乳糖、麦芽糖+可溶性淀粉，其次是可溶性淀粉。经Umezawa氏证实发酵液pH值在8.00～8.60之间是较适合合成卡那霉素[9]。从发酵液pH值可知，饴糖与麦芽糖+可溶性淀粉为碳源的发酵液pH值不在合成卡那霉素最适的pH值范围，并且摇瓶效价均低于乳糖，而乳糖在发酵5 d周期时摇瓶效价已达到最高，延长发酵周期摇瓶效价并没有增长，因此确定最佳碳源是乳糖。

2.3.5 优化发酵培养基配方验证

培养基最佳配方通过验证可以确定。初选配方：可溶性淀粉2.5 g，黄豆饼粉3.0 g，麦芽糖2.5 g，硝酸钠0.8 g，硫酸锌0.01 g，定容至100 mL，pH7.2；优化配方：乳糖6.5 g、黄豆饼粉4.0 g、硝酸钠0.8 g、硫酸锌0.03 g、硫酸亚铁0.03 g，定容至100  mL，pH7.2；按照上述配方做摇瓶验证，摇瓶培养5  d放瓶测效价。

从表13结果分析可知，优化后发酵培养基更适合卡那链霉菌代谢产物的合成，优化后配方平均摇瓶效价比对照提高了50.32%。

3 结果与讨论

通过对卡那链霉菌生长繁殖的固体培养基进行了优化试验，以葡萄糖为原料的平板培养基上生长的菌落挑单转接至斜面培养基上，菌体生长较快，但产孢子量很少，斜面不白；以饴糖为原料的平板培养基生长的菌落菌层厚硬色白，是卡那链霉菌生长的较优碳源；其次培养基pH值是影响菌体生长的关键因素，经过验证确定固体培养基自然pH值（5.04），消前pH值在7.50左右较好。影响卡那链霉菌积累代谢产物的发酵培养基经过优化验证后发现最佳的碳源是乳糖，其次摇瓶培养基中添加0.03%FeSO4后发酵液的滤速比对照提高了65.0%，摇瓶效价比对照提高了21.97%。通过对正交试验优化配方进行验证，优化后发酵培养基配方平均摇瓶效价比对照提高了50.32%。

本文通过对卡那链霉菌菌种生长的基础培养基优化后，确定了最佳培养基成分，后期可将摇瓶验证的相关物料试用于发酵罐中试验验证，有望提高产量，增加收益。

参 考 文 献

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