酱油的风味物质及其研究进展

童星，彭勃

(1.佛山市海天(高明)调味食品有限公司，广东 佛山 528511；2.佛山市海天调味食品股份有限公司，广东 佛山 528000)

酱油是以大豆、面粉等粮食作物为主要原料，经微生物发酵酿造而成具有独特色、香、味的传统调味品。目前，我国酱油每年生产量超过600万吨，约占世界总产量的60%[1]。酱油中已发现的风味物质超过300种，主要为多肽、氨基酸、低聚糖、脂肪酸、甘油以及各种有机酸与醇类经酯化生成的酯类等。韦氏辞典中对风味的定义为“所尝到的、嗅知的和触知的口中食物的总体感受”。酱油风味即为酱油的香味、滋味等，风味的形成需要在具体酿造过程中使曲霉、耐盐酵母和细菌在发酵过程中协同作用[2]。酱油的风味物质复杂而平衡，独具特色，对酱油风味物质的研究是当前调味品行业中的热点。

1 酱油风味的物质基础

酱油中的风味物质来源十分复杂，是原料中的营养成分经过一系列发酵或酶解的作用而产生的各级分解物，以及这些产物之间发生进一步的生物化学反应从而得到的产物，其涉及的过程主要包括以下几种。

1.1 通过蛋白质降解作用产生的风味物质

酱油在酿造过程中，需要用到大豆或豆粕以及小麦等粮食作物作为原料，这些原料中含有丰富的蛋白质，经过高温煮制后，原料中的蛋白质被破坏，二级结构发生改变，同时经过米曲霉等微生物分泌的蛋白酶的作用发生降解，降解产物包括多肽、寡肽和氨基酸，这些分解产物不仅能够带来鲜味，有的还能为酱油的风味提供浓厚感[3]。氨基酸类物质常常具有多种风味功能，是酱油风味中最重要的贡献者之一，例如：Ala，Gly，Ser，Thr，Lys等氨基酸具有甜味作用；而Arg，His，Phe，Leu等氨基酸则带有苦味。蛋白质降解产物不仅是酱油中主要的滋味物质，也对酱油的挥发性气味有着重要的意义，因为它们常常能够成为挥发物质的前体物质[4]。

1.2 通过淀粉的糖化作用产生的风味物质

酱油制曲过程中的重要微生物米曲霉能够在制曲阶段分泌多种酶类，其中包括液化酶(α-淀粉酶)与糖化酶(葡萄糖苷酶)这2种重要的淀粉酶。这2种淀粉酶分别针对淀粉链的α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键进行切除，在这些酶类的作用下，原料中的淀粉类物质能够被逐步水解为小分子的葡萄糖[5]。在米曲霉生长的过程中，原料中的淀粉开始分解但并不完全，直到发酵阶段，大量的淀粉酶经微生物代谢而产生，使淀粉继续糖化，生成多种小分子碳水化合物，如葡萄糖、麦芽糖和糊精等。淀粉糖化所产生的糖类物质，使酱油具有一定的甜味，并且这些糖分成为制曲及发酵过程中微生物生长的碳源，是酱油微生物发酵的物质基础。同时，碳水化合物是美拉德反应中的必需化合物之一，这就为酱油风味、色泽、体态的形成奠定了基础[6]。

1.3 通过脂肪的水解作用产生的风味物质

黄豆等原料中都含有大量的油脂，这些油脂可能会在发酵过程中发生酸败，从而导致不良气味的产生，但同时油脂的分解也会对酱油的香气做出贡献。油脂在制曲过程中可以被米曲霉所分泌的脂肪酶所降解，产生脂肪酸等物质。脂肪酸本身对香气并没有太大作用，但经过长达半年的发酵后，能够被氧化成一系列脂肪酸链等化合物，再经过进一步的化学反应，最终生成醛类、酮类、酯类等具有香气的物质。其次，油脂降解生成的各种脂肪酸与酱醪中的酵母发酵产物乙醇作用生成各种小分酯类，酯类具有芳香香气[7]。

1.4 通过其他菌种的代谢作用产生的风味物质

酵母菌和乳酸菌在酱油发酵中、后期代谢活跃，其中酵母菌如酿酒酵母和鲁氏酵母等能够分泌酒化酶，该类酶系的主要作用是将葡萄糖转化为乙醇和二氧化碳。在酱醪中，部分葡萄糖在酒化酶的作用下发生转化，同时产生一系列副产物。酒化作用后生成的乙醇，能够继续被氧化为酸类，部分进一步反应为酯类，此类物质是酱油香气的重要组成部分，另一部分继续残留在酱油中。此外，酱油中还有一些通过氨基酸脱羟基、氨基而形成的戊醇、丁醇等醇类物质，它们也具有一定的呈味作用，并且同样具有酯化反应的潜能。这些物质是酱油风味的有效增强剂，不仅能够缓解咸味，还使酱油的口感变得更加柔和、浓郁。

2 酱油风味物质的研究进展

发酵酱油的风味能够受到多种因素的影响，包括原料类型、发酵菌种、工艺条件等。随着研究水平的不断提高，近年来人们开始结合人体感官评价、分子层面研究以及人工智能分析，以达到对风味更加深入的探究效果。

2.1 酱油中香气物质的分析

类似于其他食品的风味，酱油的风味也包括香气和滋味2个重要因素。香气主要是在其发酵中形成的，这些挥发性物质相互平衡，成为酱油中特征香气的主要来源。

1961年，Yokotsuka等[8]首次在酱油中发现风味化合物4-乙基愈创木酚，并且将该物质作为酱油风味成分的指标。Nunamura等[9-11]于1978～1984年在深入探究酱油风味时，对其风味物质进行了简单的分类，即分为93种酸性物质、35种碱性物质和142种中性物质。Petra等人[12]对日本市售酱油的风味物质进行了研究，利用香味提取稀释分析(Aroma Extract Dilution Analysis，AEDA)定量分析，得到多种具有高稀释因子的活性风味物质，其中2-苯乙醇的风味稀释因子高达4096，3-甲硫基丙醛、4-羟基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)等物质的风味稀释因子为1024。同时还研究了热处理对酱油风味物质的影响，发现热处理后HEMF和HDMF等物质含量增加，酱油的整体香气发生变化。

国内也有很多研究者对酱油中的风味物质及其形成机理进行了深入的研究。熊芳媛等[13]提取了老抽酱油中的风味成分，并通过气质联用色谱仪(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)分离鉴定其化学组成，共鉴定出55种化合物，其中3,8-二羟基-2-甲基色酮等7种物质对老抽风味成分的贡献最大。张艳芳等[14]用固相微萃取(Solid-Phase Microextraction，SPME)结合GC-MS对低盐固态发酵酱油和高盐稀态发酵酱油的挥发性风味成分进行了分析，共鉴定了52种物质；具有蘑菇香气的1-辛烯-3醇等17种成分为低盐固态发酵酱油所特有；9种成分为高盐固态发酵酱油所特有。

近几年，通过人工智能结合的方式研究酱油香气物质的研究不断加深。日本的Kaori等[15]通过气相色谱-嗅觉辨别法(Gas Chromatography-Olfactrometry，GC-O)对酱油的风味成分进行分析，检测到28种活性风味物质，再利用气体提取物稀释分析(Aroma Extraction Dilution Analysis，AEDA)方法，发现了酱油中的几种高风味稀释因子物质，包括HEMF、3-甲基-1-丁醇、3-甲硫基丙醇等。Meng Qi等[16]通过GC-O测定生酱油和热处理酱油的香气物质，对香气物质的分类见表1。其中乙基-2-甲基丙酸酯、丁酸乙酯、乙基-2-甲基丁酸酯、乙基-3-甲基丁酸酯和乙基-4-甲基戊酸酯比其他芳香化合物具有较高的风味稀释因子。

表1 GC-O分析中挥发性化合物分类

总体来看，国内外对酱油香气成分的研究较多，近300种挥发性风味化合物已经被分离、鉴定，并确定HEMF、4-乙基愈创木酚、3-甲硫基丙醇等为关键酱香物质。

2.2 酱油中滋味物质的分析

酱油的滋味以咸鲜味为主，并略带有甜、酸等味道的复合体系。游离氨基酸、水溶性肽以及美拉德反应产物等是酱油的主要呈味物质。

20世纪80年代，Tomita等[17]首次发现米曲霉产生的谷氨酰胺酶能催化L-谷氨酰胺和氨基酸(或肽)间的γ-谷氨酰转肽反应。因此，将这种谷氨酰胺酶添加到酱油发酵模型中能显著降低酱油中谷氨酰胺和焦谷氨酸的含量，并增大谷氨酸和γ-谷氨酰肽的浓度，增强酱油的鲜味。

21世纪初，Lioe等[18]对日本市场上流行的3种酱油(Koikuchi，Tamari，Shiro)的成分进行了检测，发现甜味氨基酸、钠盐和谷氨酸是这3种酱油中的主要呈味物质，而通过对酱油鲜味物质的深入研究[19-21]，发现酱油鲜味基本上来源于分子量少于500 Da的超滤部分；阈下浓度的L-α-芳香簇氨基酸(L-Phe, L-Tyr)与MSG/NaCl、MSG/IMP、MSG/GMP协同作用可提升酱油的鲜味。

近几年，Kaneko等[22]运用多级色谱从酱油中分离鉴定出5个化合物： Fru-pGlu，Fru-Val，Fru-Met，pGlu-Gln，pGlu-Gly。味觉实验表明它们本身无明显鲜味，但能显著提升0.6 mmol/L谷氨酸的鲜味，味值由1.1提升至2.5；将此5种化合物加到重建酱油中，重建酱油的鲜味值由2.8提升到3.2。Frerot等[23]运用UPLC-MS/MS从酱油中新鉴定出pGlu-Asp，pGlu-Val，Lac-Glu 3个谷氨酸衍生物。2014年，Shiga等[24]通过代谢组学发现酱油中普遍存在一种比MSG和IMP鲜味更强的化合物Fru-Glu。王丹丹等[25]采用电子舌技术和多变量统计学方法，对酱油的滋味进行了评价和分析，发现市售的生抽酱油风味差异较大，尤其是咸味和酸味，而在苦味和涩味上差异较小，同时经过一系列分析发现，草酸的含量能够在一定程度上影响生抽酱油的风味。相对于酱油挥发性香味物质来说，分子水平的滋味研究比较滞后，特别是有关酱油的小分子呈鲜味化合物研究正处在迅猛发展阶段。

2.3 酱油发酵过程中的风味物质变化

酱油的酿造过程漫长而复杂，常常达到6个月以上，通过对酱油酿造过程进行追踪，能够有效研究其风味变化的规律。目前这部分的研究相对较少，但也有部分研究者以酱油整个酿造过程中的风味物质变化为线索，探究其物质变化的规律。

Young等[26]用对韩国的传统发酵酱油酿造过程中挥发性物质的变化规律进行了探究，发现了62种物质风味物质。在发酵初期，主要产生醇类、酮类、吡嗪类等物质，而酸类物质和醛类物质在初期的含量较少，随着发酵过程的进行而不断增加。高献礼，等[27]以GC-MS鉴定比较了中国传统酿造酱油在发酵5～150天的期间内酱醪中的风味物质变化，同时比较了发酵期为150天酱油在80 ℃下分别加热30 min和60 min后风味物质的变化，随着发酵期的延长和加热(80 ℃/60 min)，醇类、醛类和酮类的醇味、焦糖味有明显的减少，呋喃酮类和苯酚类以及含硫化合物则有轻微的增多。

2.4 酱油风味的改善

根据酱油风味的众多影响因素，可以通过菌种改造、原料配比等方式对酱油的风味进行探究，通常操作简便，可行性强，已有众多成果应用于酱油生产中。

早在1984年，Sugiyama等[28]对酱油中的常用发酵菌种米曲霉(A.oryzae)、酱油曲霉(A.sojae)、耐盐乳酸菌(P.halophilus)、耐盐酵母菌(S.rouxii，C.versatilis)等对酱油风味的影响进行了探讨，并确定了发酵菌株的最佳培养条件，使酱油达到最佳风味。李荔等[29]研究了在产酶能力上具有互补性能的米曲霉和酱油曲霉，结果表明：米曲霉Aspergillussojae125的谷氨酰胺酶是AS3.042的1.48倍，2个菌株最佳的复合比例为4∶1，与3.042菌株单独制曲相比，氨基氮生成率提高5.37%，L-谷氨酸生成率提高25.41%，酱油风味质量得到明显提升。

近年来，也有一些研究者通过在酱油中添加其他菌种来改善酱油的风味。Thin等[30]对泰国酱油进行了研究，将鲁氏酵母和季也蒙毕赤酵母接种在酱油酿造初期，并且对酱醪用SPME-GC-MS等方法进行检测，发现在接种以上2种酵母的酱醪中，醇类、酯类、呋喃酮、苯甲酸、麦芽酚等重要风味物质的含量更高。杨希飞等[31]在发酵过程中添加嗜盐四联球菌，发现添加106cfu/mL的嗜盐四联球菌能够改善酱油风味，使挥发性物质种数和总量上比对照组有明显增加。戚晨晨等[32]在高盐稀态酱油发酵的不同时间添加耐盐乳酸菌，发现对酱油中风味物质含量的影响较大，在45天添加乳酸菌的酱油样品中，总酸和无盐固形物的含量明显提高，含有丰富的风味物质，而在30天添加则效果相差得多。

很多研究者对酱油的发酵原料进行了优化，除了更换现有原料之外，还可以通过适当的特殊处理改变原料自身的性质，最终对酱油的风味造成影响。Zhang等[33]对原料中的豆粕进行膨化处理，使用HS-SPME和GC-MS等技术，对酱油中挥发物化合物进行鉴别，结果在膨化豆粕原料酱油(EMSF)中检测出40种挥发性化合物，而普通混合原料酱油(CMSF)中只检测出了24种，且膨化豆粕原料发酵的酱油中各氨基酸含量普遍增加，具体见表2。经研究，大豆经膨化处理后能够具有海绵状组织，增加发酵菌种与原料的接触面积，有利于菌子的生长附着，有效提高原料的利用率，使成曲获得更高的酶活力。

表2 氨基酸含量分析

另外，也有些研究者直接在酱油发酵原料中添加酶类等添加物，以提高酱油的风味水平。例如，Kijima等[34]从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中提取出具有谷氨酰胺酶活性并且耐盐的谷氨酰胺转肽酶，并将其加入到酱醪的发酵中，明显提高了酱油的鲜味。杨明泉等在酱醪发酵过程中添加0.05%的酵母抽提物可显著提高酱油原油的氨基酸态氮含量，酱油中鲜味氨基酸和苦味氨基酸的相对含量增加，甜味氨基酸的相对含量降低，酱油原油的鲜味和甜味增加。刘通讯等[35]在酱油中复合添加酵母抽提物和大豆呈味肽，结果显示酵母抽提物和大豆呈味肽按3∶2的配比添加至酱油中，酱油风味最佳，其鲜味和协调性得到了明显改善。

3 展望

总体来说，近年来人们对于酱油中风味物质已经有了较多的研究，已开发出多种菌种、原料等优化酱油风味的工艺条件，并且对挥发性香气物质以及呈鲜味物质的变化规律具有一定的认识，尤其是近10年来人工智能技术的加入，与GC-MS、HS-SPME等大型精密仪器联合使用，能够十分准确地定位各呈味物质的作用与分子结构，这也体现了未来食品中风味物质研究的发展趋势。然而，在酱油滋味的研究中，电子舌等人工智能感官系统的结合应用仍然较少，这与这项技术的众多不可控性有关，若能将味觉、嗅觉等多项人工智能技术与微生物学、有机化学、发酵工程等多学科联合运用，不仅能够更加系统地了解酱油等传统发酵调味品的风味规律，减少发酵生产中的不可控因素，也能够广泛应用于食品行业中，为其他方面的研究提供重要基础。