鲁氏酵母对豆酱品质及挥发性香气成分的影响

李志江，赵婧，戴凌燕，周雯君，徐玮东，鹿保鑫*

(1.黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学 生命科学与技术学院，黑龙江 大庆 163319；3.黑龙江农业工程职业学院学生工作处，哈尔滨 150088)

传统的豆酱生产工艺复杂，酱醅经成曲中复合酶系和天然微生物的作用，其中大豆中的大分子物质被酶降解，同时，天然微生物参与代谢合成风味物质，使得豆酱的营养丰富、香气醇厚[1,2]。但传统制酱耗时长，微生物菌系复杂，易受杂菌污染，不利于工厂化生产[3]。采用人工接种米曲霉进行制曲，在发酵阶段采用控制发酵温度和自然发酵，是一些大型豆酱企业采用的主要生产方式，而在发酵过程中接种有益微生物的应用实践与研究则较少报道。但豆酱的品质与发酵过程控制和微生物调控联系密切，如参与发酵的微生物种类和数量不足，导致产品挥发性香气较差；或者由于受季节影响，各个批次的豆酱口感和香气也可能略有差异[4,5]。因此，探讨人工接种方式进行豆酱的品质和增香效果研究，具有较好的生产指导意义。

鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)是一种常见的嗜高渗透压酵母菌，能够在高盐环境中生长。Z.rouxii利用淀粉质原料降解产生糖类等营养物质，代谢生成乙醇，并伴随产生高级醇和芳香杂醇类副产物，还能产生类似焦糖味的呋喃酮类化合物，是传统发酵调味品的重要增香微生物[6-9]，酵母菌体的自溶也是很好的增香提鲜物质[10]。李琴等[11]在低盐固态发酵酱油的工艺中，探讨了Z.rouxii和球拟酵母对酱油品质提升具有明显的效果。江洁等[12]在利用多菌发酵生产黄稀酱时，证实人工接种可缩短传统豆酱的生产周期，产品质量和风味得到显著改善。资料表明，豆酱工业化生产中添加增香酵母进行增香应用研究较少，尤其是对豆酱品质和挥发性风味物质变化影响研究鲜有报道。本研究以黑龙江某大型酱厂发酵车间为酱醅采集基地，结合企业生产情况进行试验，以豆酱总酸、总酯、氨基酸态氮含量以及感官评定为指标，以挥发性香气成分检测结果为依据，确定不同接种量鲁氏酵母对挥发性香气成分的影响，解决豆酱挥发性风味物质不足和质量低等技术难题，为豆酱产品质量提升提供数据依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱醅：来源于黑龙江省某大型酱厂发酵车间，成曲质量和发酵工艺控制均按企业标准进行。

鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)：中国工业微生物菌种保藏中心(编号1378)；YPD培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)：青岛高科园海博生物技术有限公司；氢氧化钠(NaOH)和邻苯二甲酸氢钾(C8H5KO4)：天津市大茂化学试剂厂；酚酞和甲醛：烟台三和化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PE20酸度计 Mettler Toledo公司；79-1磁力搅拌器 江苏省金坛市虹盛仪器厂；THZ-82恒温水浴振荡器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；Trace 1300气相色谱仪和质谱仪 Thermo Scientific公司；TDZ5-WS离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；SHP-250恒温培养箱 上海森信实验仪器有限公司；LDZX-50KBS高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂。

1.3 实验与检测方法

1.3.1 样品制备

取酱厂发酵第7天的酱醅(发酵温度43～45 ℃)，接种(0.5～2.0)×106个/g鲁氏酵母，分别继续发酵至14天(发酵温度42～44 ℃)、21天(发酵温度37～39 ℃)和28天(发酵温度37～39 ℃)，翻酱次数和温度控制按企业标准执行，测定酱醅的总酸、总酯和氨基酸态氮含量等常规指标。

1.3.2 常规指标的检测方法

滴定法测定酱醅中总酸含量(按GB/T 5009.39-2003进行测定，单位g/100 g)，甲醛电位法测定酱醅中氨基酸态氮含量(按GB/T 5009.39-2003进行测定，单位g/100 g)，回流滴定法测定酱醅中总酯含量(按GB/T 10345.5-1989进行测定，以乙酸乙酯计，单位g/100 g)。

1.3.3 感官评价方法

采用线性标度法，对发酵至第28天的豆酱进行色泽、体态和香气感官评定[13]。

1.3.4 挥发性香气成分测定方法

采用气相色谱和质谱联用(GC-MS)的方法[14]对人工接种Z.rouxii和未接种的酱醅进行挥发性香气物质分析。

取各处理的酱醅7 mL，置于15 mL样品瓶中，每个样品中分别加入2.0 g的氯化钠(NaCl)，经过混合后密封待测。在样品瓶中插入100 μm PDMS萃取纤维头，将纤维头暴露于样品瓶的顶空气体中，40 ℃恒温萃取50 min(转速250 r/min)后，将萃取头插入气质联用仪进样口进行解吸。

气相色谱条件：DB-5毛细管柱子(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱箱温度为50 ℃；进样温度为240 ℃，载气为He，流速为1 mL/min；采用程序升温的方式，起始温度为50 ℃，保持2 min，再以4 ℃/min的速度使温度增加至240 ℃，保持5 min的恒定时间，不分流进样。质谱设定的条件：能量要求：EI电离源，能量为70 eV，倍增电压1400 V；温度要求：离子源的温度为200 ℃，接口温度设定为250 ℃，四级杆温度设定为150 ℃，扫描范围为40～450 m/z，时间间隔为0.3 s。

1.4 软件使用与数据处理

数据处理采用平均值±标准偏差方式表示，利用Excel 2007软件进行作图。利用计算机谱库进行挥发性成分的定性分析，并用峰面积归一化法定量，测定2次取平均值。非参数检验利用SPSS 19.0软件计算。

2 结果与分析

2.1 鲁氏酵母对豆酱品质的影响

该企业豆酱发酵周期为28天，并调控温度，以达到产品的企业和国家标准。前期7天发酵温度为43～45 ℃，主要目的是利用成曲中的蛋白酶和淀粉酶等水解大豆中的大分子物质，为微生物生长代谢提供小分子物质[15]。按照企业的生产要求，为保障豆酱产品质量和调控发酵工艺参数，对发酵过程和酱醅品质进行了监控。

图1 不同接种量的鲁氏酵母对酱醅品质及感官评价影响结果Fig.1 Effects of Zygosaccharomyces rouxii on the content of total acidity, total ester and amino acid nitrogen and sensory evaluation during the fermentation of soybean paste

注：图1中Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ分别为酱醅发酵至第14，21，28天的总酸、总酯和氨基酸态氮含量测定结果，图1中Ⅳ为感官评价结果；a与A分别表示各处理组相应指标与对照组相比较显著性差异P<0.05和P<0.01，未标注为无显著性差异；b与B分别表示处理组内，与相应最高值指标相比较显著性差异P<0.05和P<0.01，未标注为无显著性差异。

图1中Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ分别为不同接种量时发酵至第14，21，28天时，酱醅中总酸、总酯和氨基酸态氮的含量测定结果。由图1中 Ⅰ 可知，与未接种鲁氏酵母对照组比较，接种鲁氏酵母的处理组酱醅(发酵温度42～44 ℃)中，总酯含量逐渐增加，且最大值提高了2.06 g/100 g，而总酸和氨基酸态氮含量则变化不明显。说明鲁氏酵母的接入改变了酱醅的天然发酵进程，代谢产生的醇类化合物发挥了主要作用，并与乳酸菌等代谢产生的酸类物质化合形成酯类，导致酱醅的酯类香气物质含量显著增加。处理组内，1.5×106个/g接种量时的酱醅中，总酸含量最高，推测是鲁氏酵母与酱醅中天然存在的微生物之间具有拮抗作用，产酸菌及酸类化合物占优势，应进一步分析微生物之间的数量和消长因素。随着酱醅发酵至第21天(中期发酵)和温度降至37～39 ℃(见图1中Ⅱ)，当接种量为2.0×106个/g时，处理组中的总酯含量与对照相比含量仅增加了1.00 g/100 g，而总酸和氨基酸态氮含量则分别增加了0.17，0.12 g/100 g。处理组内，总酯含量增加，但含量差异较7～14天小，最大差异仅为0.65 g/100 g；总酸含量随着接种量增加呈现先增加后减少的趋势，最高值为2.85 g/100 g，氨基酸态氮含量差异较小。此阶段是在较低温度下完成的，且微生物代谢处于旺盛阶段，是酱醅发酵的关键过程和决定代谢产物含量的主要时期，微生物的拮抗和代谢产物的累积也十分明显[16]。总酸含量增加表明产酸微生物虽然继续发挥主要作用，可能由于营养底物的消耗、温度的降低和菌体的老化，造成鲁氏酵母等代谢生成醇类物质减少，其与酸类的化合作用生成酯类物质的能力减弱。在酱醅后发酵和成熟时期的7天(见图1中Ⅲ)，与对照组相比较，总酯含量继续缓慢升高至最大差异量为0.86 g/100 g，氨基酸态氮含量继续增加至最大为0.24 g/100 g。接种量为1.5×106个/g时，总酸含量最大差异为0.87 g/100 g；处理组内则各指标差异较小，说明不同接种量的鲁氏酵母之间发酵能力差异逐渐减弱。

以上结果表明，控温发酵和鲁氏酵母的接入，调控酱醅总酸、总酯和氨基酸态氮含量，3个指标在监测时间点内各值增加逐渐变缓，至发酵结束时，均较对照组含量高，说明鲁氏酵母可以较好地提高豆酱的品质。

2.2 豆酱感官评价结果

利用线性标度法，对发酵28天的成熟豆酱进行感官评定，见图1中Ⅳ。随着Z.rouxii接种量增大，豆酱色泽、体态、香气等感官评分逐渐呈现上升的趋势，且均高于对照组。当接种量为2.0×106个/g时，豆酱的色泽、体态、香气等感官得分均高于其他处理组，豆酱的外观颜色呈现较好的红褐色且具有光泽，粘稠度适中，酱香浓郁。主要由于较高接种量代谢累积总酯及其他挥发性香气物质所致，同时，豆酱的感官质量符合企业产品标准。

2.3 豆酱挥发性香气成分测定与分析

利用上述实验结果，分别对未添加和添加2.0×106个/gZ.rouxii的豆酱进行了挥发性香气成分分析，结果见表1。

表1 挥发性香气成分含量分析表Table 1 Aroma components content in soybean paste

续 表

注：“-”表示测试结果未检出；琥布宗为4-丁基-4-(羟甲基)-1,2-二苯基-3,5-吡唑烷二酮丁二酸单酯。

未添加Z.rouxii的豆酱检测出挥发性香气成分共22种，其中醇类4种、酯类5种、酸酚类6种、醛酮类3种以及其他类4种，分别占总挥发性香气成分的5.04%，11.11%，12.12%，3.56%，3.78%；添加2.0×106个/gZ.rouxii的豆酱中，检测出挥发性香气成分34种，其中醇类6种、酯类10种、酸酚类7种、醛酮类5种以及其他类6种，分别占总挥发性香气成分的9.56%，64.82%，9.62%，2.31%，5.01%。

2种豆酱中挥发性香气成分差异较大，其中添加Z.rouxii的豆酱中挥发性香气成分增加了12种，但也有9种挥发性香气成分与对照组相同。各组分峰面积比变化较大，醇类和酯类成分的组分和含量明显增加，与上述鲁氏酵母增加酱醅中的总酯含量测定结果一致。同时，Z.rouxii的添加可以改善豆酱的挥发性香气成分，使得豆酱香气浓郁，与上述豆酱的感官评价结果吻合。

2.3.1 醇类物质的比较分析

酵母菌是代谢贡献醇类化合物的主要微生物，醇类化合物阈值高，对风味的贡献主要是与酸类化合进一步形成酯类化合物，主要作为酯类物质合成的前体物质[17]。与对照豆酱样品相比，处理组中醇类总峰面积增加了4.52%，但2组样品中均检测出具有玫瑰香气感受的苯乙醇，其峰面积比由1.32%上升至3.61%，进一步解释了豆酱香气增加的原因。鲁氏酵母的主要作用是醇类发酵，并进一步合成多种酯类香气成分、甘油和多元醇以及其他酮、酚等物质，在豆酱的品质和感官评价中具有重要的作用[18]。

2.3.2 酯类物质的比较分析

酯类物质是豆酱香气的重要组成部分，样品中酯类峰面积比由对照组的11.11%增加至64.82%，且种类变化较大，其中处理组酯类物质种类增加了8种。棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯在2组样品中均被检出，鲁氏酵母的添加导致其含量也显著增加。酯类物质是豆酱香气的重要化合物，为豆酱提供甜香和果香等感官特征，主要来自于酵母酶催化合成，其次是由有机酸和醇的酯化反应合成[19]。Z.rouxii不仅代谢产生乙醇主产物，还可以生产高级醇及芳香杂醇类次生代谢产物，同时，在高盐环境中还能转化糖类物质生成多元醇及糖醇类风味物质，并进一步与酸类物质化合成酯类物质[20]。此外，具有水果香的苯甲酸乙酯也在处理组中检测到，为豆酱酯香提供了化学依据，与已有的报道结果相似[21]。

2.3.3 酸酚类物质的比较分析

添加鲁氏酵母的豆酱中，酸物质的种类和峰面积比显著下降7.33%，是由于鲁氏酵母代谢产生多种醇类物质并消耗酸而发生酯化反应所致。而添加鲁氏酵母后，酚类含量及种类明显提高；同时，具有木香味的4-乙基愈创木酚和具有烟熏香味的对乙烯基愈创木酚这2种酚类化合物还具有辛香、药香、木香及类似丁香的香气，且含量显著提升，对豆酱香气的形成贡献很大[22,23]。在赵建新等及徐琳娜等[24]对传统豆酱挥发性成分分析中，这2种物质也被检测到且含量较高。

2.3.4 醛酮类物质的比较分析

醛酮类成分均是不稳定的中间体化合物，其含量超过阈值易使豆酱形成令人不舒服的气味，在2组豆酱中均含具有类似风信子和水果的甜香气的苯乙醛和苯甲醛，含量相差不大，这2种醛都是由高级醇和不饱和脂肪酸的氧化产生的。只在接种鲁氏酵母的样品中检测出酮类物质，可能是鲁氏酵母代谢产物，其含量与鲁氏酵母代谢有关。同时，脂肪分解可产生一定量的醛类和酮类化合物。

2.3.5 其他类物质的比较分析

主要是烷烃类、醚类和酰胺类物质，2种豆酱中的峰面积相差不大，但处理组中种类更加丰富。烃及其衍生物是一些小分子代谢产物，对豆酱的香气贡献较小[25]，但可以作为酵母菌的营养源，进一步合成酯类物质，在处理组豆酱中可能由鲁氏酵母代谢合成。而醚类可能是在较高温度下，由醇类脱水化合而成。

2.4 因子分析

为检验添加和未添加鲁氏酵母的豆酱挥发性香气总体的均值是否有显著的差别，采用2个独立样本非参数检验——Mann-Whitney U检验进行因子分析，结果见表2和表3。

表2 秩和检验结果Table 2 Values of rank sum

表3 检验统计量aTable 3 Test Statisticsa

注：a为分组变量：组别。

通过SPSS 19.0软件对挥发性香气成分数据进行统计分析(已知P=0.05)，通过数据统计的结果可知，2组独立数据P=0.000<0.001，即与处理组相比较，Z.rouxii对豆酱中挥发性香气成分的提升效果非常显著，说明Z.rouxii对豆酱香气感官的影响非常显著，提升了豆酱产品质量。

3 结论

该研究是在企业标准条件下，探讨人工接种鲁氏酵母对豆酱总酸、总酯、氨基酸态氮含量的影响与监控，结果表明：鲁氏酵母可显著提高不同发酵阶段酱醅各指标含量。酸类物质在前期发酵过程中变化最大，为酱醅中、后期挥发性香气物质提供了基础。随着发酵进入中期和后期以及酱醅温度的降低，总酯含量增加，赋予豆酱醇厚的香气。感官评定指标结果进一步表明：鲁氏酵母的添加可显著提高豆酱的感官和理化品质，为鲁氏酵母的工厂化应用提供了基础。挥发性香气成分分析结果表明：Z.rouxii对豆酱香气产物的生成具有显著影响，添加Z.rouxii可以明显改善豆酱挥发性香气成分，提高了豆酱产品质量，为Z.rouxii在豆酱生产中的工业化应用提供了数据支持。