响应面法优化紫薯中花色苷的提取工艺

钱镭，任德财，姜涛，辛雪，胡淑敏，刘婷*

(1.黑龙江东方学院 食品与环境工程学部，哈尔滨 150066；2.黑龙江龙丹乳业科技有限公司，哈尔滨 150086)

紫薯，又叫黑薯，薯肉呈紫色至深紫色。紫薯生长在较温暖的地方，茎叶适宜生长温度为18～25 ℃，温度低于15 ℃时停止生长[1，2]。根最适生长的地温为22～24 ℃，地温低于20 ℃时紫薯停止膨大。紫薯主要分布在广西、广东、湖北、湖南、江西、福建、亚洲的其他热带地区。野生紫薯的块茎多为棒状或圆柱形，表面黑色或棕色，断面紫色、白色或黄色。紫薯可去皮切片烘干，将其粉碎后加工成紫薯粉，色泽美观，营养成分丰富，可以作为食品加工的原料，还可作为各种糕点类的主料或配料。同时紫薯将成为花色素的主要原料之一。

天然食用色素的来源广泛，种类丰富而且大多数对人体无毒害作用，它们除具有特殊的色、香、味外，还具有保健和营养作用，用作食品添加剂既能使产品更贴近食品本身的色泽，又可增加食品的风味特性[3]。在自然界中，花青素是植物中主要的呈色物质之一，是一类水溶性的天然色素，属多酚类类黄酮化合物，又名花色素[4]。它普遍存在于植物的茎、花、果肉及叶的液泡里，是自然植物的次生代谢产物，由于pH 对其色泽的影响较大，在酸性环境中呈现红色，在碱性环境中则显现蓝色，因此能赋予植物特殊的颜色[5]。花色苷对致癌物质有抑制作用，还具有抑制肥胖，增强人体免疫力，增强体质，延缓衰老，提升视力等多种作用[6-8]。

试验使用有机溶剂法来提取紫薯的花色苷[9]，在预处理期间采用水蒸气加热方式处理紫薯。进行适当时间的蒸煮处理，使富含在紫薯中的糖苷发生水解，使花青素以不同程度进行释放，进而产生糖苷化作用生成花色苷[10]。加热状态下，紫薯花色苷形态会发生改变，先从结合态转变为游离态，细胞壁被破坏后，细胞液中渗出花色苷，使花色苷的含量有所增加[11]。使用真空冷冻干燥方法能更好地保留紫薯原有的营养成分与色泽，以保护容易氧化的物质。本文还研究了提取温度、料液比、乙醇浓度、提取时间对紫薯花色苷提取的影响，并采用响应面优化分析的方法，得到了提取工艺的最佳参数，为天然色素的提取工艺及应用提供理论参考[12]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫薯：由江苏省兴化市味野食品有限公司提供；醋酸钠、无水乙醇、盐酸、氯化钾：均为分析纯，选自天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FW100高速万能粉碎机 上海书培实验设备有限公司；FDU-1100冷冻干燥机 东京理化器械株式会社；SH11YX/UV-8000S紫外-可见分光光度计 上海陵光技术有限公司；LD5-2B低速高效离心机 北京京立离心机有限公司；JJ200电子分析天平 常熟市双杰测试仪器厂；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱，HWS-26电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 紫薯预处理

将紫薯洗净，放在室温下使其表皮水分完全蒸发，用刀切成厚度为1 cm的薄片，将其放入蒸气蒸煮，温度为100 ℃，时间为20 min(蒸熟)，然后用刀切成厚度为0.5 cm的薄片，将其放在冷冻干燥机中，于-20 ℃下预冻24 h之后，再进行真空冷冻干燥，使冻干后的紫薯薄片粉粹过筛(80目)得到紫薯粉。

1.3.2 紫薯花色苷提取

按照一定料液比，将紫薯在80%乙醇和60 ℃的条件下提取1 h后，提取液离心(5000 r/min)5 min后，过滤得到花色苷的上清液，反复提取2次，合并上清液放于瓶中待用。

1.3.3 紫薯花色苷含量测定

采用pH示差法来测定紫薯花色苷含量。由试验可知紫薯花色苷的最大吸收波长为535 nm。吸取待测液2.0 mL，分别用pH 1.0 和pH 4.5的缓冲溶液稀释至一定体积。分别在535 nm处和700 nm处测定提取溶液的吸光度(A)，以干质量计算，计算公式如下：

花色苷含量(mg/g)=A/(ε×L)×MW×DF×V/m。

式中：A=(A535pH 1.0-A700pH 1.0)-(A535pH 4.5- A700pH 4.5)；V为溶液定容的体积：mL；DF为溶液的稀释倍数；MW为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26900 L/(mol·cm)；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔质量，449.2 g/mol； L为比色皿的宽度，1 cm；m为样品紫薯质量，g。

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 研究提取时间对紫薯花色苷含量的影响

称取紫薯粉末2.000 g，以60%乙醇为溶剂，按料液比1∶20，在60 ℃下分别提取30，60，90，120，150 min进行试验。

1.3.4.2 研究料液比对紫薯花色苷含量的影响

称取紫薯粉末2.000 g，以60%乙醇为溶剂，分别以料液比1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，在60 ℃下提取90 min进行试验。

1.3.4.3 研究提取温度对紫薯花色苷含量的影响

称取紫薯粉末2.000 g，以60%乙醇为溶剂，按料液比1∶20，分别在提取温度为30，40，50，60，70 ℃下提取90 min进行试验。

1.3.4.4 研究乙醇浓度对紫薯花色苷含量的影响

称取紫薯粉末2.000 g，分别以浓度为50%，60%，70%，80%，90%的乙醇为溶剂，料液比 1∶20，在60 ℃下提取90 min进行试验[13]。

1.3.5 用响应面法优化提取花色苷工艺

以提取温度、乙醇浓度、提取时间、料液比为自变量，以提取液中的花色苷含量为响应值，采用中心组合设计3水平4因素的响应面试验，其试验因素水平表见表1。

表1 试验因素水平表Table 1 Experimental factors and levels table

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对花色苷含量的影响

图1 提取时间对花色苷含量的影响Fig.1 Effect of extraction time on the content of anthocyanins in the extract

由图1可知，花色苷随着提取时间的增加，在溶剂中一点点地溶出，在90 min时，花色苷含量逐渐达到最大值。长时间的提取会导致花色苷的降解，与此同时溶剂也会挥发一部分，使一部分花色苷损失。因此，选择提取时间90 min作为紫薯花色苷的最佳提取条件。

2.1.2 料液比对花色苷含量的影响

图2 料液比对花色苷含量的影响Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the content of anthocyanins in the extract

由图2可知，紫薯花色苷含量在料液比增加的条件下，趋势为先增大后减小。当料液比过低时，等同于稀释了溶剂，这样不能充分把花色苷提取出来。料液比逐渐增加，使花色苷溶解于溶剂中，由于料液比过高的情况下，也会导致紫薯粉不能与溶剂充分接触，这对于花色苷全部溶出产生阻碍作用。因此，选择料液比1∶20作为紫薯花色苷的最佳提取条件。

2.1.3 提取温度对花色苷含量的影响

图3 提取温度对花色苷含量的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the content of anthocyanins in the extract

由图3可知，花色苷含量在提取温度为60 ℃时达到最高。在30～50 ℃之间时，紫薯粉在溶剂中的溶解能力和溶剂中的扩散速度随着提取温度的升高而增加，使花色苷含量逐渐上升[14]。温度在60～70 ℃之间，花色苷出现降解的现象，温度升高也会导致乙醇含量的挥发，使其溶出量减少，花色苷总体含量降低。

2.1.4 乙醇浓度对花色苷含量的影响

图4 乙醇浓度对花色苷含量的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on the content of anthocyanins in the extract

由图4可知，花色苷含量在乙醇浓度为60%时达到最大值。不同乙醇浓度对花色苷含量的提取有显著影响，当乙醇浓度较低时，花色苷含量会随乙醇浓度的升高而增加，而当乙醇浓度大于60%时，紫薯花色苷的提取率反而随着乙醇浓度的升高而降低。因此，选择乙醇浓度为60%作为紫薯花色苷的最佳提取条件。

2.2 响应面优化紫薯花色苷提取工艺

2.2.1 响应面试验设计及结果

在单因素试验的基础上，设计响应面优化试验，试验为4因素3水平，其试验设计和结果见表2。

表2 试验设计及结果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

应用 Design Expert 8.0.6 软件，以乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度为响应变量，以花色苷含量为响应值，对表2的数据进行二次多项式拟合，得到的预测模型如下：

Y=1.20-0.017A-0.0089B+0.028C+0.021D+0.0089AB-0.015AC+0.032AD+0.038BC-0.022BD-0.003CD-0.10A2-0.033B2-0.082C2-0.041D2。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

注：R2=0.9105,RAdj2=0.8923,C.V.(%)=3.88,“**”表示极显著(p<0.01)，“*”表示显著(0.01

由表3可知，此试验模型中的P值<0.01，响应面回归模型表示达到显著水平，其失拟项值为0.9793(p>0.05)，不显著；相关系数R2=0.9105，RAdj2=0.8923，说明该模型与实际试验有良好的拟合性，此模型可行。根据F值可知，回归模型中各因素对总花色苷含量的影响大小顺序为C>D>B>A，即：料液比>提取时间>提取温度>乙醇浓度。模型中A2，C2对花色苷含量的影响极显著(p<0.01)；A，C，D，D2的影响显著(p<0.05)；此模型的C.V.为3.88，说明该模型可以较好地反映响应值的变化。

2.2.2 因素交互作用对花色苷含量的影响

通过Design Expert 8.0.6软件得到各因素间的等高线图和响应曲面, 进一步考察各因素之间的交互作用。等高线的形状为圆形，表示交互作用不显著；若其形状为椭圆，表示交互作用显著。

2.2.2.1 提取温度和乙醇浓度的交互作用

提取温度和乙醇浓度对花色苷含量的影响见图5。

图5 提取温度和乙醇浓度对花色苷含量的影响Fig.5 Effect of extraction temperature and ethanol concentration on the content of anthocyanins in the extract

2.2.2.2 料液比和乙醇浓度的交互作用

乙醇浓度和料液比对花色苷含量的影响见图6。

图6 乙醇浓度和料液比对花色苷含量的影响Fig.6 Effect of ethanol concentration and solid-liquid ratio on the content of anthocyanins in the extract

2.2.2.3 提取时间和乙醇浓度的交互作用

提取时间和乙醇浓度对花色苷含量的影响见图7。

图7 提取时间和乙醇浓度对花色苷含量的影响Fig.7 Effect of extraction time and ethanol concentration on the content of anthocyanins in the extract

2.2.2.4 料液比和提取温度的交互作用

料液比和提取温度对花色苷含量的影响见图8。

图8 料液比和提取温度对花色苷含量的影响Fig.8 Effect of extraction temperature and solid-liquid ratio on the content of anthocyanins in the extract

2.2.2.5 提取温度和提取时间的交互作用

提取温度和提取时间对花色苷含量的影响见图9。

图9 提取温度和提取时间对花色苷含量的影响Fig.9 Effect of extraction temperature and extraction time on the content of anthocyanins in the extract

2.2.2.6 料液比和提取时间的交互作用

料液比和提取时间对花色苷含量的影响见图10。

图10 料液比和提取时间对花色苷含量的影响Fig.10 Effect of solid-liquid ratio and extraction time on the content of anthocyanins in the extract

2.2.3 验证试验

通过软件分析得出最佳工艺参数：乙醇浓度为59.7%，料液比为1∶21，提取时间为98.4 min，提取温度为58.7 ℃，花色苷含量为1.20353 mg/g。以此条件进行验证试验，测得花色苷含量为1.3392 mg/g，与理论预测值接近，说明可以用此模型来优化紫薯花色苷的提取工艺条件。

3 结论

在单因素试验的基础上，采用Box-Benhnken中心组合设计4因素3水平的响应面试验，对紫薯中花色苷的提取工艺条件进行优化，利用pH示差法测定花色苷的含量。其最佳工艺条件为提取时间98.4 min，提取温度58.7 ℃，料液比1∶21，乙醇浓度59.7%。利用此工艺参数得到的花色苷含量为1.3392 mg/g，结果与理论值相似，此工艺参数可为天然色素的研究提供理论依据。