桑葚与红糖初始质量比对桑葚酵素抗氧化活性的影响

何 偲，黄元霞，邱忠平，李 萍，徐 柳

（西南交通大学 生命科学与工程学院，四川 成都 610031）

关键字：桑葚；酵素；红糖；抗氧化物质；抗氧化活性

人体因新陈代谢和外界因素的影响会不断产生自由基，自由基的过量产生会打破人体正常平衡而引起氧化应激反应，导致细胞损伤和变异，从而加速衰老，并引发各种炎症性疾病、糖尿病、甚至诱发癌症[1-3]。酵素是以水果或蔬菜为原料，添加一定比例的糖发酵而成，其中富含维生素C、总酚、花色苷、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等具有抗氧化活性的物质，能抑制或消除自由基，阻止机体细胞受到自由基的损害，减少机体的损伤和疾病的发生[4-5]。但这些抗氧化物质稳定性较差，容易受到pH值、温度、有机酸、光照、氧、糖含量等影响而发生变化[6]。因此，减少抗氧化物质的流失是未来保健食品的研究重点。红糖富含蔗糖、氨基酸、微量元素、抗氧化性物质等成分，具有极高的营养价值。适量的红糖对保持酵素营养成分含量和提升抗氧化活性具有重要意义。

目前，我国对酵素的抗氧化性研究大多集中在其发酵过程中抗氧化性能的变化规律[7-8]，关于红糖比例对酵素抗氧化性能的影响研究未见报道。本文以不同比例的桑葚与红糖制作的酵素为研究对象，比较其中的维生素C、总酚、花色苷等抗氧化活性物质含量及其抗氧化活性。并应用模糊数学综合分析法得出最优的桑葚与红糖初始质量比例，为开发具有高抗氧化性的酵素产品提供理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Eppendorf 5427R台式高速离心机（Eppendorf）；V-1100D型可见分光光度计（上海美谱达）；JY5002电子天平（上海舜宇恒平）；UV-2450紫外分光光度计（日本岛津公司）；SHZ-B水浴恒温振荡器（上海跃进）；pHS-3C+总酸计（成都世纪方舟）；发酵罐（10 L，上海安买）。

1.2 材料

桑葚，红糖（桂林百寿元食品公司），均为市售。

2 方法

2.1 桑葚酵素的制备

用无菌水轻轻冲洗桑葚表面除去尘土，在无菌环境下自然晾干；将红糖在紫外灯下照射杀菌1 h。将桑葚与红糖（总质量为12 kg）分别按质量比1:1，3:1，5:1，7:1，9:1加入已灭菌的发酵罐中混匀，分别编号为Ⅰ#、Ⅱ#、Ⅲ#、Ⅳ#、Ⅴ#，密封后置暗处常温发酵360 d。为防止外源微生物的污染，所有操作均在无菌环境下进行。

2.2 测定方法

采用pH计测定pH值；NaOH滴定法测定总酸[8]；3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量[9]；重铬酸钾氧化法测定酒精度[10]；紫外分光光度法测定维生素C含量[11]，Foli-Ciocalteu’s法测定总酚含量[12]，pH试差法测定花色苷含量[13]，结果分别以等价没食子酸、抗坏血酸、矢车菊素-3-葡糖苷表示；取酵素的10倍稀释液1 ml测定还原力、羟自由基清除率、超氧自由基清除率进行，方法参照文献[14]。

2.3 数据处理及分析

实验结果均为5个平行样的平均值，采用Excel 2007对试验数据进行基本处理，SPSS 20.0对数据进行显著性及相关性分析，模糊数学分析法综合评判出最优桑葚与红糖比例。

3 结果

3.1 5组桑葚酵素理化指标的比较

采用pH值、总酸、还原糖含量、酒精度作为桑葚酵素理化指标，5组桑葚酵素的理化指标检测结果见表1。

表1 5组桑葚酵素的理化指标比较（±s）

表1 5组桑葚酵素的理化指标比较（±s）

注：**P＜0.01 vs Ⅰ#

组别 pH 蔗糖含量/mg·ml-1 还原糖含量/mg·ml-1 总酸/g·L-1 酒精度/%Ⅰ# 4.16 347.016±0.223 491.729±3.337 4.719±0.001 4.615±0.003Ⅱ# 3.63** 119.915±0.111** 186.453±1.539** 9.976±0.004** 5.849±0.003**Ⅲ# 3.91** 134.805±0.077** 89.060±0.214** 15.109±0.06** 8.342±0.006**Ⅳ# 3.77** 41.979±0.077** 33.469±0.233** 15.440±0.06** 6.858±0.005**Ⅴ# 3.78** 33.945±0.309** 3.680±0.203** 16.350±0.06** 4.833±0.003**

由表1可见，Ⅰ#的pH、蔗糖、还原糖含量最高（P＜0.01），总酸、酒精度最低（P＜0.01）。

表2 5组桑葚酵素的抗氧化活性比较（±s）

表2 5组桑葚酵素的抗氧化活性比较（±s）

注：**P＜0.01 vs Ⅰ#

组别 维生素/mg·ml-1 总酚/mg·ml-1 花色苷/mg·L-1 还原力 对羟自由基清除率/%对超氧自由基清除率/%Ⅰ# 90.348±0.879 14.935±0.606 101.553±3.654 0.283±0.003 36.142±0.115 12.171±0.061Ⅱ# 82.026±0.937** 16.244±0.610** 52.730±3.654** 0.072±0.003** 13.301±0.130** 13.675±0.558**Ⅲ# 94.727±1.573** 12.592±0.398** 46.871±3.904** 0.176±0.002** 14.338±0.167** 13.081±0.324**Ⅳ# 83.759±1.350** 12.394±0.484** 27.341±2.392** 0.157±0.003** 14.453±0.130** 16.855±0.314**Ⅴ# 82.708±0.764** 11.545±0.651** 21.482±2.392** 0.162±0.003** 16.833±0.410** 13.442±0.732**

3.2 5组桑葚酵素抗氧化活性比较

以桑葚酵素的维生素C、总酚、花色苷含量、还原力、对羟自由基清除能力和对超氧自由基的清除能力作为桑葚酵素抗氧化活性的指标，结果见表2。

由表2可见，5组桑葚酵素的维生素C含量均高于80 mg/ml，Ⅰ#的维生素C含量略低于Ⅲ#，高于Ⅱ#、Ⅳ#、Ⅴ#（P＜0.01）。Ⅰ#的总酚含量为14.935 mg/ml，略低于Ⅱ#，高于Ⅲ#、Ⅳ#、Ⅴ#（P＜0.01）。花色苷含量随着红糖比例的降低逐渐降低，Ⅰ#的花色苷含量高于其余4组（P＜0.01）。由此可见，Ⅰ#即桑葚与红糖初始质量比为1:1时所得桑葚酵素的抗氧化物质含量相对较高。

5组桑葚酵素中Ⅰ#的还原力、对羟自由基清除率最高，对超氧自由基清除率5组差别不大。由此可见，Ⅰ#即桑葚与红糖初始质量比为1:1时所得桑葚酵素的体外抗氧化活性相对较高。

3.3 模糊数学分析法评判结果

模糊数学分析法是模糊数学提供的一种解决多因素、多指标评估问题的数学模型[15]。由于维生素C含量、总酚含量、花色苷含量等各抗氧化物质含量和还原力、对羟自由基清除率、对超氧自由基清除率等抗氧化活性指标在数据和单位上都有很大的差别，因此要对5组桑葚酵素的抗氧化活性进行比较，不能单单通过比较某一个抗氧化性指标的检测数据，可以通过模糊数学分析法对各抗氧性指标的检测数据进行无因次化处理而进行综合分析。

首先选取五组桑葚酵素抗氧化性能评价的指标体系U，U={uij}，其中i表示5组酵素的维生素C、总酚、花色苷、还原力、对羟自由基清除率、对超氧自由基清除率6项指标，j表示组别数。uij表示i项指标的第j组数值。再将表3中各抗氧化性指标原始数据的平均值进行极值标准化处理，构成模糊转化矩阵R，最大值记为1（maxij=1），最小值记为0（minij=0）。中间值（rij）根据模糊数学分析法所属函数的定义进行计算，即R=（rij），rij=（uij-minij）/（maxij-minij）。采用标准离差法计算权重。所得模糊转化矩阵R结果见表3。

表3 模糊转化矩阵R

通过等权和加权法分别对5组桑葚酵素的抗氧化活性进行比较，数值越大表明其抗氧化性能越优，所得结果见表4。

表4 模糊数学分析法结果及排序

综合分析结果取等权和加权的和值，数值越大表明抗氧化活性越高。从表4可见，抗氧化活性排序依次为Ⅰ#＞Ⅲ#＞Ⅱ#＞Ⅳ#＞Ⅴ#。即桑葚与红糖的初始质量比为1:1时所得桑葚酵素的抗氧化活性最高。

3.4 抗氧化物质与抗氧化体系之间的相关性分析

采用SPSS 20.0 对维生素C、总酚、花色苷3种抗氧化物质和还原力、对羟自由基清除率和超氧自由基清除率3种抗氧化体系进行相关性分析，结果见表5。

表5 抗氧化物质与抗氧化体系之间的相关性分析

由表5可见，抗氧化物质与抗氧化体系间呈不同相关性。其中，花色苷与还原力、对羟自由基清除率和超氧自由基清除率呈显著相关性，相关系数r分别为0.631，0.853，0.589（P＜0.01）。

4 讨论

4.1 初始糖含量与酵母菌对糖的转化有直接联系。酵素发酵过程中酵母菌利用桑葚和红糖完成自身繁殖并将糖转化为酒精等代谢产物。研究发现，5组桑葚酵素的酒精含量大小顺序为：5:1＞7:1＞3:1＞9:1＞1:1。这与马兆瑞等[16]的研究结果一致，发酵产物的酒精含量随着糖含量的增加而增加，但糖含量过高会抑制酵母菌的发酵，导致残余蔗糖含量增加。因此，5组桑葚酵素的残余蔗糖、还原糖含量随着桑葚与红糖比例的增加而逐渐减少。

4.2 酵素中高浓度的糖能阻止抗氧化物质的氧化，有利于维生素C、总酚和花色苷的保存。维生素C、总酚、花色苷等抗氧化物质随着存放时间的延长极易氧化损失。王亚楠等[17]发现，添加蔗糖能降低溶液中的含氧量，从而提高维生素C的保存率；樊金玲等[18]发现，蔗糖抑制花色苷的降解，从而提高了花色苷的贮藏稳定性，且抑制程度与蔗糖浓度呈正相关。因此，虽然桑葚与红糖初始比例为1:1时的桑葚质量最少，但残余蔗糖含量最高，所得酵素的维生素C、总酚、花色苷含量高。

4.3 还原力、对羟自由基清除率、对超氧自由基清除率通常是体外抗氧化活性的常用体系。维生素C、总酚、花色苷等抗氧化物质具有抑制自由基产生或直接清除自由基、激活抗氧化酶体系等作用[19]。但各种抗氧化物质在抗氧化活性体系中呈现不同的相关性[20-21]。本文通过SPSS 22.0对抗氧化物质与体外抗氧化活性的相关性分析发现，花色苷与还原力、对羟自由基清除率和超氧自由基清除率呈显著正相关，而维生素C、总酚与其无明显相关性，表明花色苷含量对体外抗氧化活性影响最大。因此，初始质量比为1:1时所得桑葚酵素的花色苷含量最高，其还原力、对羟自由基清除率也最强。

5 结论

应用模糊数学分析法对桑葚酵素抗氧化活性进行综合评判，排序依次为：1:1＞5:1＞3:1＞7:1＞9:1。表明桑葚与红糖初始质量比为1:1时，所得桑葚酵素的抗氧化活性最高。