大鼠原位单向肠灌流模型研究两种多糖类药物肠道降解动力学

邵华荣，房绍英，吴季栩，刘 飞，马 河，凌沛学，程艳玲

（山东省药学科学院，山东 济南 250101）

多糖口服具有抗疲劳、抗抑郁、保肝、抗疟疾、调血脂、提高免疫力等药理活性[1-4]。本课题组前期研究证实，人参多糖口服可提高免疫力，贻贝多糖口服具有显著调血脂活性，但药动学研究发现，两者口服原型多糖生物利用度极低。深入探索多糖类药物口服生物利用度低与其良好活性之间的关联，应首先对多糖口服后的转运过程进行研究。大鼠原位单向肠灌流模型，是研究药物吸收代谢的重要模型之一[5-7]，我们采用此模型对人参多糖与贻贝多糖口服后在肠道内的降解进行了研究。

1 材料

1.1 仪器

AUW-120D电子分析天平，LC-20AT高效液相色谱仪，RID-20AT示差折光检测器（日本岛津）；高速微量冷冻离心机（美国赛默飞世尔）；加比士C6T微量注射泵（浙江史密斯医学仪器公司）；DK-98-II电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器公司）。

1.2 试药

贻贝多糖（山东省药学科学院自制，批号20160501）；人参多糖（山东省药学科学院自制，批号20161222）；无水氯化钙，葡萄糖，NaCl，KCl，NaHCO3，NaH2PO4，MgCl2，均为国产分析纯。Krebs-Ringer缓冲液为灌流液（简称K-R试液），其组成为：NaCl 133.5 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl23.3 mmol/L，NaH2PO42.67 mmol/L，MgCl20.21 mmol/L，NaHCO316.3 mmol/L，D-葡萄糖7.8 mmol/L。

1.3 动物

SD大鼠12只，体重范围190～210 g，雌雄各半，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。饲养条件：SPF级环境饲养，每笼5只，室温19～26 ℃，湿度40 %～70 %，日温差≤4 ℃，换气次数8～10次/h，昼夜明暗交替时间12 h/12 h，试验前适应饲养7 d。实验动物使用许可证号：SYXK（鲁）2014 0008。

2 方法与结果

2.1 含量测定

两种多糖含量均采用HPLC-示差折光检测器进行分析。

贻贝多糖分析条件：色谱柱型号TSK-GEL G5000PWXL，流动相为0.05 mol/L 硝酸钠溶液，流速0.5 ml/min，柱温40 ℃，检测器温度35 ℃，进样量20 µl。贻贝多糖相对保留时间约11.7 min，线性关系良好（r=0.9992），线性范围为0.25～1.5 mg/ml，RSD≤6.22 %，回收率为96.58 %～107.41 %。

人参多糖分析条件：TSK-GEL G3000PWXL，流动相为0.05 mol/L 磷酸二氢钠溶液，流速：0.6 ml/min，柱温：35 ℃，检测器温度40 ℃。人参多糖相对保留时间约11.8 min，线性关系良好（r=0.9986），线性范围为0.25～1.5 mg/ml，RSD≤5.78 %，回收率为90.60 %～111.22 %。

2.2 大鼠原位肠灌流试验

取12只SD大鼠，其中贻贝多糖及人参多糖灌流组各6只，雌雄各半，试验前禁食12 h以上，自由饮水，腹腔注射1 %戊巴比妥溶液40 mg/kg，麻醉后固定，沿腹中线剖开腹部，分别小心分离选取待考察肠段（十二指肠、空肠、回肠、结肠），并于两端切小口，以37 ℃生理盐水冲净肠腔后插管并用手术线结扎，管路进出口处于同一高度， 伤口用浸有生理盐水的纱布覆盖保湿并用手术灯照射保持体温[5]。肠段划分方法：十二指肠段为距幽门1 cm处起；空肠段为距幽门15 cm处起；回肠段为盲肠部位上行20 cm处起；结肠段为紧邻盲肠后端起至直肠，各段均取10 cm左右。

各肠段先用一定浓度的多糖灌流液以0.2 mL/min流速灌流20 min后，保持流速不变，改用已称重装有多糖溶液的注射器进行肠灌流，同时出口处用已称重的接液瓶接收灌流液，以首滴接收液滴下算起，收集15 min的接收液，将接液瓶称重并记录。采用质量法校正肠内水分吸收引起的灌流液体积的变化，计算泵入供试液体积Vin=min/ρin（泵入肠内供试液质量min，测定密度为ρin），接收液体积Vout=mout/ρout（接收到的灌流液质量mout，测定密度为ρout），Vin与Vout的差异即是肠道吸收或分泌的水分的体积。供试液及接受液内多糖测定按2.1项方法进行。处死大鼠，轻柔剪下被考察肠段，以手术线附着法测量长度（l）和周长，计算内径（r）。

按以下公式计算药物的降解速率常数（Ka）及降解百分率（P%）[5]。

公式中，v为灌流速度（ml/min），Cin、Cout为供试液及接收液的多糖药物浓度（mg/L），l和r为灌流肠段的长度（cm）和半径（cm）。

2.3 贻贝多糖在不同肠段的降解

10 mg/ml贻贝多糖在各肠段的降解情况见表1。由表1可见，十二指肠段各接收液样本均未见贻贝多糖色谱峰，表明贻贝多糖在十二指肠可全部被降解，在空肠段的降解百分率为40.33 %±15.65 %，在回肠和结肠部位，贻贝多糖降解百分率较低，分别为0.70 %±0.49 %和0.30 %±0.14 %，表明大分子贻贝多糖原型在回肠和结肠较难吸收或降解。

表1 各肠段对贻贝多糖的降解

2.4 人参多糖在不同肠段的降解

6 mg/ml人参多糖在各肠段的降解情况见表2。人参多糖在各肠段均有不同程度的降解，其中，回肠部位的降解百分率较大，为52.41 %±13.14 %，结肠部位降解较少，仅为0.68 %±0.54 %。十二指肠和空肠部位的降解百分率分别为25.19 %±17.02 %和33.04 %±15.26 %。

表2 各肠段对人参多糖的吸收

3 讨论

本研究采用HPLC结合示差折光检测器，分别建立了测定大鼠肠灌流液中贻贝多糖和人参多糖原型含量的方法，该法线性范围为0.25～1.5 mg/ml，回收率和精密度良好，可用于两种多糖类药物大鼠在体肠灌流试验研究。

本课题组前期药代动力学研究发现，贻贝多糖口服及人参多糖口服并未在血浆中检测到多糖原型，而本研究发现两种多糖在肠灌流流出液中含量均大幅降低，因此，推测两种多糖是在肠道内发生了降解。相比于采用模拟肠液进行多糖体外降解试验，大鼠原位在体肠灌流模型可全面地包含肠内多糖降解酶，更为科学合理。

贻贝多糖在十二指肠段的降解百分率为100 %，这可能是因为贻贝多糖（Mr1.20×106）主链中含α 1→4糖苷键，为胰淀粉酶的作用靶点，因此，推测贻贝多糖口服发挥调血脂活性的可能是其寡糖。人参多糖（Mr2.9×104）在各肠段均存在部分降解，在回肠内的降解百分率最大，约52 %，说明人参多糖调节机体免疫的作用可能是其寡糖和部分多糖。由此也证实，在多糖口服活性与作用机制研究中，将多糖直接加入体外细胞培养体系中进行的相关研究，与多糖类药物口服后的体内作用途径相差甚远[8]。

两种多糖类药物降解形成的寡糖是否可被吸收尚需进一步研究，而另一方面，肠道菌群可能是多糖及其寡糖作用的肠内靶点。近年，肠道菌群与机体免疫及各种慢性疾病之间的关系得到充分证实[9-10]，而多糖和寡糖作为肠道菌群的底物，可能对菌群的定植和代谢起到非常重要的作用。将多糖消化道转运过程与其对肠道菌群的影响相结合，对阐明多糖口服的作用途径具有重要意义。