Rho相关激酶抑制剂在牙髓干细胞分化中的作用

郑丽玲 许立志 玄云泽

作者单位：133000 吉林延吉，延边大学附属医院口腔科（郑丽玲、玄云泽）；空军军医大学口腔医院（许立志）

随着牙齿发育，牙齿结构中的成牙本质细胞逐渐分化并分泌胶原蛋白和牙本质涎蛋白（DSP）、牙本质磷蛋白（DPP）、骨钙素（OC）等非胶原蛋白[1]。研究表明，Rho相关激酶（Rho associated kinase， ROCK）抑制剂可促进干细胞及成骨细胞分化[2]，对神经损伤也具有良好的疗效[3]，但对牙髓干细胞分化的作用尚未明确。本研究利用牙髓干细胞确认ROCK抑制剂对牙髓干细胞分化的作用。

1 材料与方法

1.1 培养牙髓干细胞 经患者本人同意，收集我院口腔科18～30岁因正畸需要或因阻生门诊拔除的健康完整恒牙，乙醇擦拭牙体表面后用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，在无菌条件下沿牙体长轴劈开牙冠，超净台中去牙髓，PBS反复冲洗。用眼科剪将牙髓剪成小块，加入I型胶原酶37℃消化、离心、弃上清。收集细胞接种于培养皿，CO2、饱和湿度的培养皿内培养，翻瓶，每隔3d换一次液，待细胞长至80%时酶消化法传代培养，利用相差显微镜观察细胞形态。

1.2 细胞培养及分化 传代好的牙髓干细胞用含10%胎牛血清和抗生素（青霉素100U/ml、链霉素 100μg/ml、两性霉素 B 2.5μg/ml）以及非必需氨基酸的a-MEM培养液在37℃标准环境下培养到80%～90%为止。为促进细胞分化，在a-MEM培养液里加入抗坏血酸维生素C（AA，50μg/ml）和β-甘油磷酸（GP，10mM）培养细胞15d。牙髓干细胞的实验组加入ROCK抑制剂Y-27632（10μM），对照组只加入分化培养液。

1.3 茜素红S染色 取生长良好的牙髓干细胞（2.7×105cells/35mmdish）培养 0d、5d、10d、15d，用冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次，70%乙醇固定20min，用1%茜素红S染色后于显微镜下观察。

1.4 RT-PCR检测基因的表达 分别培养0d、5d、10d、15d的牙髓干细胞用提取试剂提取总RNA，测定纯度后按RT-PCR试剂盒说明合成cDNA，用骨钙素（OC）、碱性磷酸酶（ALP）、骨唾蛋白（BSP）及GAPDH特定primer合成引物。RT-PCR产物经终琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统成像并拍照。

2 结果

2.1 茜素红S染色结果 牙髓干细胞分化5d茜素红S染色阳性并可见矿化结节，分化10d、15d，ROCK抑制剂实验组观察矿化结节比对照组更显著。见图1。

2.2 RT-PCR检测OC、ALP、BSP基因的表达水平从分化第5天开始，牙髓干细胞的OC和ALP基因表达水平增高，ROCK抑制剂实验组比对照组表达更强，维持到分化第15天。BSP基因于第10天出现表达分化，ROCK抑制剂比对照组表达更强。见图2。

图2 RT-PCR检测结果

3 讨论

Rho激酶，又称Rho相关激酶（Rho associated kinase， ROCK），是 Rho GTP 酶处于激活状态时被激活的重要下游分子，是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。ROCK诱导形成应力纤维和黏着斑，Rho/ROCK信号通路通过调节细胞肌动蛋白（actomyosin）骨架的聚合状态，参与调控细胞形态维持、细胞黏附与增殖、分化、细胞移动等生物学行为[4，5]。本研究分离培养牙髓干细胞研究ROCK抑制剂对牙髓干细胞的分化和矿化形成。牙髓干细胞是位于牙髓组织的一种成体干细胞。Gronthos等[6]于2000年首次从牙髓中分离得到干细胞，他们将人类健康的第三磨牙牙髓经过酶消化法传代培养，得到了具有高度增殖能力的细胞，将其命名为牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）。目前，由于牙髓干细胞缺乏特异的表面分子标记，对其鉴定是将其分化为成牙本质细胞，通过检测BSP、OC、ALP等相关标记物的变化可鉴定其分化能力。研究表明[7]，牙髓干细胞在体外培养诱导分化时，形成细胞结节，继而矿化形成矿化结节，经检测这种矿化结节主要为牙本质样的矿化基质，具有牙本质的特性，这些结节Von Kossa染色和茜素红染色均为阳性。本实验以茜素红S染色法检测细胞的结节形成及矿化，分化5d，ROCK抑制剂（Y-27632）实验组比对照组表现出更强的阳性，分化15d达到高峰并形成结节。因此，矿化结节可作为牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的标志。OC由成熟的成骨细胞产生，主要分布在骨组织的细胞外基质中，是牙髓干细胞分化为成牙本质样细胞的标志基因[7，8]。ALP是参与钙化组织形成、代谢的重要物质，又是细胞分化成熟和成骨能力的标志之一[7]。随着细胞分化的发展并开始钙化时，ALP的活性显著增强。本实验结果显示，从分化第5天开始可检测到OC和ALP的活性，ROCK抑制剂（Y-27632）实验组表达的OC和ALP活性快速升高，明显高于对照组。说明ROCK抑制剂可诱导牙髓干细胞的分化，且该分化过程出现在细胞增殖的较早期阶段。目前，牙髓干细胞被公认对于牙髓的损伤修复具有重要的作用。通过本研究检测结果，ROCK抑制剂促进牙髓干细胞系细胞的分化与矿化，提示牙髓干细胞成为牙髓-牙本质复合体的种子细胞，为牙髓再生的实现提供了理论可能。