高糖对小鼠肾小球内皮细胞中的缺氧诱导因子-1α及血管内皮生长因子表达的影响

余玲 董瑞鸿 宋秋艳 甄月巧 赵明明 桑艳红 郭珏涵

作者单位：450052 河南郑州，郑州大学第五附属医院内分泌科

糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病最常见的慢性微血管并发症，亦是导致终末期肾功能衰竭的最重要原因之一，已成为一种严重危害公共健康的问题，在发达国家糖尿病肾病是导致终末期肾功能衰竭的首要原因，在我国也已跃居第二位[1]。糖尿病肾病的发展往往伴随着细胞因子介导的慢性低水平炎症反应[2]。其中HIF-1α、VEGF与糖尿病肾病的发展密切相关。HIF-1α在糖尿病肾病发病过程中起到了重要作用，当受到缺氧作用时，HIF-1α会在细胞中大量积累并与HIF-1β相结合而发挥作用，使其稳定性得到进一步增强，糖尿病肾病患者出现缺血缺氧的情况会产生严重的并发症[3]。VEGF作为一种多肽生长因子，与血管增殖相关，能够通过增加血管通透性来促进内皮细胞的增殖与血管的生成，其含量的高低能够直接反映出血管内皮细胞的损伤程度，其存在会加重糖尿病肾病的发生与发展[4]。

本研究通过体外培养肾小球内皮细胞，ELISA法检测不同血糖浓度培养液上清中的HIF-1α以及VEGF的蛋白水平；RT-PCR法检测高血糖对肾小球内皮细胞中的HIF-1α及VEGF的mRNA的表达水平的影响，进一步研究HIF-1α及VEGF在糖尿病肾病中的发病作用与机制，为糖尿病肾病并发症的防治提供新的靶点。

1 材料与仪器

1.1 实验细胞株 小鼠肾小球内皮细胞（江阴齐式生物科技有限公司货号：1-3032）。

1.2 实验试剂 胎牛血清（GIBCO，批号：1036489）；DMEM（HyClone，批号：NXH0684）；超纯RNA提取试剂盒（CWbio.Co.Ltd，批号：CW0581）；HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒（CWbio.Co.Ltd，批号：CW0744）；Ultra-SYBR Mixture（CWbio.Co.Ltd，批号：CW0956）；5xRNA Loading Buffer （CWbio.Co.Ltd，批号：CW0611A）；DNase 1（CWbio.Co.Ltd，CW2090）；无水乙醇，异丙醇（上海化学试剂公司）；HIF-1α ELISA试剂盒（上海远慕生物科技有限公司，型号：YM-6235）；VEGF ELISA试剂盒（上海研谨生物科技有限公司，货号：F04894）。

HIF-1α、VEGF和β-actin基因均购自Gene Copoeia® USA公司，具体的序列分别为：

HIF-1α:上游：5'-CAGATGACGGCGACATGG TT-3'；下游：5'-GCAGGTTCCACGTTGCTGAC-3'。

VEGF：上游：5'-AGGCAGACTATTCAGCGGAC TC-3'产物片段 214bp；下游：5'-CTCTTTCGTCTGC TGATTTCCAC-3'。

β-actin上游：5'-CTGTCCCTGTATGCCTCTGG TC-3'产物片段 225bp；下游：5'-CTCTTTGATGTCA CGCACGCACGATTTC-3'。

1.3 实验仪器与耗材 医用净化工作台（吴江市净化设备总厂，型号：YJ-875A）；低温台式离心机（长沙鑫奥仪器仪表有限公司，型号：16K-R）；精密分析天平（瑞士Mettler公司，型号：AE240）；二氧化碳培养箱（美国SHELDON公司，型号：CUSA31311）；倒置相差显微镜（日本尼康，型号：TS-100F）；紫外/可见光分光光度计（美国赛默飞世尔公司，型号：Nanodrop-2000）；-80℃超低温冰箱（日本Sanyo公司，型号：MDF-382E）；荧光定量 PCR仪（ABI，型号：ABI StepOne）；电泳仪（北京六一仪器厂，型号：DYY-6C）；全自动酶标仪（美国BIOTEK公司）；移 液 器，PCR 管（0.2ml），八 连 管，Tip头（10μl、200μl、1 000μl）均购自 AXYGEN 公司。

2 实验方法

2.1 细胞的培养与分组

2.1.1 细胞的培养 将购入的细胞进行细胞复苏后常规培养：小鼠肾小球内皮细胞选用含有10%胎牛血清的DMEM低糖培养，将其置于37℃，5%CO2培养箱中培养，根据培养基颜色及细胞生长情况更换新鲜培养基。

2.1.2 高浓度葡萄糖以及缺氧联合高浓度葡萄糖干预 CoCl2是一种化学性的低氧模拟物，能够在正常的氧分压下通过与Fe2+竞争氧来达到常氧条件下缺氧的目的，是公认的HIF-1α活性诱导剂，通过上调HIF-1α的基因表达，增加活性氧的生成，促进caspase-3以及p-38MARK的表达，引起多种细胞的凋亡，从而达到模拟缺氧损伤的目的[5]。

将生长良好处于对数生长期的肾小球内皮细胞1×105接种于6cm的培养皿中，培养过夜；更换1%FBS培养基同步化处理细胞12h后，将其依次接种于T25的培养瓶中；采用10%FBS, DMEM 低糖，37℃，5%CO2培养，待细胞完全贴壁生长之后，根据实验需求更换不同的培养基溶液。

正常对照组：加入含有5.5mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养液；高糖非缺氧组A：加入含有11.1mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养液；高糖非缺氧组B：加入含有22.2mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养液；高糖非缺氧组C：加入含有33.3mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养液；缺氧对照组：加入事先配置好的含5.5mmol/L葡萄糖及100μmol/L CoCl2的DMEM细胞培养液；高糖缺氧组A：加入含有11.1mmol/L葡萄糖及100μmol/L CoCl2的DMEM完全培养液；高糖缺氧组B：加入含有22.2mmol/L葡萄糖及100μmol/L CoCl2的DMEM完全培养液；高糖缺氧组C：加入含有33.3mmol/L葡萄糖及100μmol/L CoCl2的DMEM完全培养液培养72h后进行相关ELISA及RT-PCR检测[6]。

2.2 指标检测

2.2.1 ELISA法检测不同血糖浓度培养液上清中的HIF-1α及VEGF的蛋白水平 具体的实验操作步骤按照试剂盒中的说明进行，其标准品浓度分别为：1 000、500、250、125、62.5、31.2、15.6pg/ml，实验步骤结束之后，使用酶标仪在450nm处检测OD值，将空白显色孔设置为对照组，将所有标准品及样品的吸光值减去空白孔吸光值后于坐标纸上绘制标准曲线，其中吸光值为纵坐标，浓度为横坐标，根据样品的吸光值得出其最终的浓度。

2.2.2 RT-PCR法检测 RT-PCR法检测高血糖对肾小球内皮细胞中的HIF-1α和VEGF的mRNA水平表达的影响。实验前所有仪器与耗材均按照标准进行灭菌处理，按照超纯RNA提取试剂盒中的具体步骤进行小鼠肾脏内皮细胞总RNA的提取，采用紫外分光光度计检测所提取的RNA样本260、280nm处的吸光度，测定提取RNA的纯度，将提取出的总RNA用HiFiScriptcDNA第一链合成试剂盒进行反转录，将反转录所得的样本进行实时荧光定量PCR检测，具体的实验操作步骤参考产品说明书进行，原始检测结果采用2-△△CT法将所得数据进行相对定量分析。

2.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据的分析处理，组间的比较采用单因素方差分析，各组计量数据用均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组肾脏内皮细胞中HIF-1α及VEGF蛋白表达的差异 正常对照组、高糖非缺氧组（不同浓度）、缺氧对照组及高糖缺氧组（不同浓度）肾小球内皮细胞中的HIF-1α以及VEGF水平均呈逐渐升高趋势，与正常对照组比较，高糖非缺氧组C、缺氧对照组以及高糖缺氧组（不同浓度）HIF-1α以及VEGF水平均显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；高糖非缺氧组（不同浓度）肾小球内皮细胞中的HIF-1α以及VEGF水平低于缺氧对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；高糖缺氧组（不同浓度）肾小球内皮细胞中的HIF-1α以及VEGF水平均显著高于缺氧对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表1 各组肾脏内皮细胞中HIF-1α及VEGF蛋白表达的差异（±s，ng/ml）

表1 各组肾脏内皮细胞中HIF-1α及VEGF蛋白表达的差异（±s，ng/ml）

注：与缺氧对照组比较，1）P＜0.05，与高糖缺氧组A比较，2）P＜0.05，与高糖缺氧组 B 比较，3）P＜0.05，与高糖缺氧组 C比较，4）P＜0.05

组别 HIF-1α VEGF正常对照组 0.075±0.0081） 2） 3） 4） 366.55±14.451） 2） 3） 4）高糖非缺氧组高糖非缺氧组 A 0.072±0.0081） 2） 3） 4） 369.88±19.601） 2）3） 4）高糖非缺氧组 B 0.089±0.0011） 2） 3） 4） 491.64±56.931） 2）3） 4）高糖非缺氧组 C 0.125±0.0061） 2） 3） 4） 551.42±4.491） 2）3） 4）缺氧对照组 0.232±0.015 3） 4） 851.42±22.733） 4）高糖缺氧组高糖缺氧组 A 0.295±0.009 3） 4） 857.32±24.233） 4）高糖缺氧组 B 0.403±0.0071） 2） 4） 966.74±24.221） 2） 4）高糖缺氧组 C 0.597±0.0161） 2） 3） 1137.65±105.491） 2） 3）

3.2 各组肾脏内皮细胞中HIF-1α及VEGF mRNA表达的差异 正常对照组、高糖非缺氧组（不同浓度）、缺氧对照组及高糖缺氧组（不同浓度）肾小球内皮细胞中的HIF-1α和VEGF基因mRNA表达水平均呈逐渐升高趋势，其中高糖非缺氧组（不同浓度）肾小球内皮细胞中的HIF-1α基因mRNA表达水平低于缺氧对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；高糖缺氧组（除去高糖缺氧组A）肾小球内皮细胞中的HIF-1α基因mRNA表达水平均显著高于缺氧对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；缺氧对照组肾小球内皮细胞中的VEGF基因mRNA表达水平与正常对照组以及高糖缺氧组B、C比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），其中正常对照组＜缺氧对照组＜高糖缺氧组B＜高糖缺氧组C；高糖缺氧组B、C肾小球内皮细胞中的VEGF基因mRNA表达水平均显著高于其它各组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表 2。

表2 各组肾脏内皮细胞中HIF-1α及VEGF mRNA表达的差异（±s）

表2 各组肾脏内皮细胞中HIF-1α及VEGF mRNA表达的差异（±s）

注：与缺氧对照组比较，1）P＜0.05，与高糖缺氧组A比较，2）P＜0.05，与高糖缺氧组 B 比较，3）P＜0.05，与高糖缺氧组 C比较，4）P＜0.05

组别 HIF-1α VEGF正常对照组 1.00±0.141） 2） 3） 4） 1.02±0.221） 2） 3） 4）高糖非缺氧组高糖非缺氧组 A 1.13±0.131） 2） 3） 4） 2.16±0.483） 4）高糖非缺氧组 B 1.15±0.131） 2） 3） 4） 2.55±0.123） 4）高糖非缺氧组 C 1.68±0.021） 2） 3） 4） 3.58±1.623） 4）缺氧对照组 5.36±0.78 3） 4） 3.89±0.463） 4）高糖缺氧组高糖缺氧组 A 5.76±0.743） 4） 4.59±0.923） 4）高糖缺氧组 B 7.41±1.241） 2） 4） 8.97±0.941） 2） 4）高糖缺氧组 C 9.21±0.631） 2） 3） 15.21±3.451） 2） 3）

4 讨论

糖尿病肾病作为终末期肾病的主要病因之一，与心脏病，脑血管疾病同为糖尿病的三大并发症之一，早期糖尿病造成肾脏的改变，慢性肾小管的损伤及缺氧是近年来有关于糖尿病肾病发病机制研究的热点之一[7]。HIF-α是一种在缺氧状态下特异性发挥活性的转录因子，在糖尿病并发症的防治过程中具有十分重要的意义，VEGF作为HIF-α的下游基因，其浓度与表达水平会受到HIF-α表达的影响，目前关于两者之间关系的研究不多，通过研究糖尿病肾病中HIF-α与VEGF的水平，进一步探讨糖尿病肾病与二者之间的关系，能够为糖尿病肾病的发病机制提供一定的实验依据。

糖尿病肾病发病时会导致肾脏的局部微循环发生一定障碍，使得局部组织处于缺氧状态，“慢性缺氧”成为了肾脏疾病发展到终末期肾病的共同通路，HIF-1作为一种具有转录活性的异源二聚体，由α和β两种亚基组成，是适应慢性缺氧环境的一种核心转录因子，其中HIF-1α受到氧浓度的调节，在代谢调节中扮演着重要的角色，在糖尿病肾病的发展过程中也起到了十分重要的作用[8]。HIF-1α与糖尿病及其并发症密切相关，在高血糖的情况下，能够导致一系列相关并发症的发生发展，高血糖通过对肾脏中HIF-α水平以及活性的改变能够损伤肾脏对缺氧环境的一种适应性，进而延缓皮肤的愈合，现代研究发现HIF-1α在糖尿病大鼠肾脏中的表达增加，通过减少HIF-1α的表达能够有效减少糖尿病大鼠尿蛋白以及肌酐水平，从而改善肾脏的功能，达到保护肾脏的目的[9,10]。缺氧是导致氧化应激的重要诱因，而氧化应激在糖尿病肾病的发展过程中起到了重要的促进作用，当氧浓度维持在正常水平时，HIF-1α在细胞内维持较低的水平，动物实验研究也表明当HIF-1α水平上调时能够诱导糖尿病大鼠肾小管以及肾小球细胞凋亡增加，导致糖尿病肾病病情的进一步发展，因此适当减少HIF-1α的含量与糖尿病肾病的防治密切相关[11,12]。本次实验结果显示与正常对照组比较，高糖非缺氧组肾小球内皮细胞中的HIF-1α蛋白表达及mRNA表达均无显著改变（P＞0.05），而缺氧对照组肾小球内皮细胞中的HIF-1α蛋白表达及mRNA表达与高糖非缺氧组及正常对照组比较均显著升高（P＜0.05），进一步证明了缺氧状态能够上调HIF-1α表达，进而造成糖尿病肾病的发展[8]，因此在总体上降低HIF-1α的表达对于糖尿病肾病的防治有着十分重要的意义；与缺氧对照组比较，高糖缺氧组B、C中HIF-1α蛋白表达及mRNA表达均显著升高（P＜0.05），说明高糖、低氧环境能够进一步诱导HIF-1α表达增强，这种表达会随葡萄糖浓度的增加而逐渐增强。

肾脏尤其是肾小球是人类VEGF的主要来源，VEGF水平的高低直接反映了血管内皮细胞的损伤程度，VEGF作为一种内皮细胞特异性的丝裂原，糖尿病时VEGF及其受体的表达上调，造成进展性的蛋白尿以及肾小球的塌陷最终产生肾功能的衰竭，低氧是导致VEGF水平上调的最强刺激因子，其含量的高低直接反映出血管内皮细胞的损伤程度，作为缺氧活化的HIF-1α下游靶基因，抑制其表达能够有效地改善糖尿病造成的肾脏损伤[13]。有研究表明小鼠在低氧环境下脑组织、肾脏、睾丸以及肺脏中的VEGF表达均有所增加，具体的作用机制可能与低氧造成肾小球内皮细胞的通透性增加有关[14,15]。VEGF含量的增加会导致肾小球通透性增加，基底膜增厚，进而增加尿蛋白含量，通过抑制VEGF含量能够有效改善这一情况[16]。本次实验研究结果显示VEGF的蛋白表达及mRNA表达与HIF-α的变化相似，也呈现出与正常对照组比较，高糖组、缺氧对照组以及高糖缺氧组逐渐增加的趋势，且缺氧对照组肾小球内皮细胞中的VEGF蛋白表达及mRNA表达与高糖非缺氧组及正常对照组比较均显著升高（P＜0.05），高糖缺氧组B、C中VEGF蛋白表达及mRNA表达均显著升高（P＜0.05），这一结果也进一步证实了作为HIF-1的靶基因，VEGF会随着HIF-1α的增加而逐渐增加，糖尿病肾病的病情会随着HIF-1α以及VEGF的水平增高而逐渐加重。

综上所述，HIF-1α及VEGF在糖尿病肾病的发生发展过程中起到了重要的作用，高糖联合缺氧对肾小球内皮细胞中HIF-1α、VEGF表达的影响作用更强，因此早期对血糖的控制干预能够有效延缓其对组织的损伤，控制糖尿病肾病的发生与发展。