茜素红“开关式”荧光探针测定水中微量铜

吕雅娟，史欣荣，李志英

(1.山西医科大学汾阳学院 医学检验系，山西 汾阳 032200；2.忻州师范学院 化学系，山西 忻州 034000)

铜是一种广泛存在于环境中的常见金属,人体内的适量铜离子有利于维持机体的正常运行，若体内铜代谢不平衡会给人带来疾病[1].近年来，工业的快速发展引起了环境水质不同程度的污染，尤其是重金属离子对生活饮用水的污染，严重威胁到人类的生命健康[2]，因此，寻求一种灵敏、快捷、高效的重金属检测方法具有非常重要的意义.铜为重金属之一，目前，用于水环境中铜污染物检测的方法有电感耦合等离子体原子发射光谱法[3]、共振光散射法[4]、原子吸收光谱法[5]、电感耦合等离子体质谱法[6]、络合滴定法[7]、电化学分析法[8]、催化动力学光度法[9]、溶出伏安法[10]、荧光检测法[11]，荧光检测法由于其具有灵敏度高、选择性较好等优点受到了国内外研究者的青睐.茜素红(alizarin red,AR)是众多染料中具有代表性的染料之一，属于蒽醌类化合物，被广泛用于染料、酸碱指示剂，能与许多金属离子生成红色络合物[12]，但茜素红与金属离子作用生成荧光物质鲜见报道，本实验通过对不同金属离子在不同的pH下与茜素红生成荧光物质的研究发现，pH=5.2时，茜素红-铝络合生成发射橙黄色荧光的络合物，Cu2+得电子能力大于Al3+，所以Cu2+与茜素红络合的稳定常数大于Al3+与茜素红络合的稳定常数[13]，但是，Cu2+和Al3+所带电荷和得电子能力不同，导致它们与茜素红生成的络合物共轭作用和空间结构不同，因此，Cu2+的加入猝灭了茜素红-铝络合物的荧光，且荧光强度随着Cu2+浓度的增加降低，由此建立开关式测定水中微量铜的新方法，该方法具有操作简单、灵敏度高等优点.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津RF-5301PC荧光分光光度计；数显恒温水浴锅HH-8(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；AL204 电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；茜素红(国药集团化学试剂有限公司)：准确称取1.401 1 g茜素红，用少量蒸馏水溶解后定容到100 mL容量瓶中，得4×10-2mol/L储备液，用时稀释为4×10-4mol/L的工作液；Cu2+标准溶液：准确称取1.703 8 g Cu(NO3)2固体，用少量蒸馏水溶解后定容到100 mL容量瓶中，得1×10-2mol/L Cu(NO3)2储备液，用时稀释为1×10-4mol/L的工作液.本实验所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水.水样来自云中河河水.

1.2 实验方法

1.2.1 茜素红与金属离子作用的方法

取2支25 mL的比色管，均加入4×10-4mol/L的茜素红溶液1 mL，醋酸缓冲溶液3 mL,其中一支加入1×10-4mol/L的金属离子溶液2 mL，用HCl和NaOH调pH，2支均定容到25 mL.在室温下反应10 min后用1 cm的荧光比色皿在469 nm激发波长下测定585 nm波长处的荧光强度.

1.2.2 茜素红-铝测定Cu2+的方法

取2支25 mL比色管，均依次加入4×10-4mol/L茜素红溶液1 mL，1×10-4mol/L Al(NO3)3溶液6 mL,其中一支加入1×10-4mol/L铜离子标准溶液2 mL，另一支不加.加水定容至25 mL，置于30 ℃水浴锅中加热10 min，流水冷却3 min，用1 cm的荧光比色皿于469 nm激发波长下测定585 nm处的荧光强度，茜素红-铝-铜体系荧光强度(F)和茜素红-铝体系的荧光强度(F0)，并计算ΔF的值(ΔF=F0-F).

2 结果与讨论

2.1 茜素红和金属离子的作用

为了研究茜素红与12种金属离子的荧光光谱，按1.2.1的方法，固定其他条件不变，加入12种金属离子，只改变各溶液的pH依次为4、5、6、7，测量溶液的荧光强度.结果如图1所示.

由图1可知，不同pH下，茜素红和金属离子作用的荧光光谱不同，研究发现茜素红能与许多金属离子络合，但是pH不同各种离子的络合能力不同，并且在pH=4～7时只有Al3+、Pb2+、Zn2+和茜素红络合物发出荧光，而在pH=5时茜素红能与过量的Al3+离子结合，生成强荧光络合物，Pb2+、Zn2+形成的络合物荧光较弱，与其他金属作用的生成物几乎没有荧光.

图1 不同pH条件下茜素红与不同金属离子作用的荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra of alizarin red interacting with different metal ions at different pH

2.2 茜素红和Al3+作用的荧光光谱

为了研究茜素红及茜素红加铝离子的荧光光谱，按1.2.1的方法，固定其他条件不变，配制加入Al3+与不加Al3+的溶液，只改变各溶液的pH依次为4、5、6、7、8，测量溶液的荧光强度.结果如图2和图3所示.

图2 茜素红与铝作用荧光光谱Fig.2 Fluorescence spectra of alizarin red with Al3+

图3 茜素红的荧光光谱Fig.3 Fluorescence spectra of alizarin red

由图2和图3可知茜素红在pH=4、5、6时，在558 nm处有弱荧光，加入Al3+在585 nm处发出较强的荧光，当pH=7、8时在630 nm处有荧光，加入Al3+荧光强度基本不变，可以说明pH对茜素红络合Al3+影响较大.

2.3 茜素红-铝与Cu2+作用的荧光光谱

取25 mL的比色管，分别加入4×10-4mol/L的茜素红溶液1 mL，溶液呈黄色，依次加入5×10-5mol/L的硝酸铝溶液0、2、4、8、10、12 mL，溶液由黄色变成橘黄色，然后加水定容.按1.2.2的方法测量溶液的荧光强度.结果如图4所示.

按实验1.2.2的方法，分别配制茜素红、茜素红-Al(NO3)3、茜素红-Al(NO3)3-Cu(NO3)2，在激发波长469 nm和发射波长585 nm处测量溶液的荧光强度.结果如图5所示.

图4 铝离子和茜素红作用的荧光光谱Fig.4 Fluorescence spectra of aluminum ion and alizarin red

图5 铜离子对茜素红-铝的荧光猝灭光谱Fig.5 Fluorescence quenching spectra of copper to aluminum and alizarin red complex

由图4可知：茜素红在559有较弱的荧光，Al3+的加入使吸收峰红移至585 nm处，且随着Al3+浓度增加，荧光强度增强，过量的Al3+和茜素红形成稳定的络合物,但加入浓度更大的Al3+荧光强度升高较小，且已经超过本仪器检测的范围(1 000).这种方法可以选择测定一定浓度的Al3+，但线性范围较小，检出限高，所以不做研究，本实验用4×10-4mol/L的茜素红溶液1 mL加入1×10-4mol/L的Al(NO3)3溶液6 mL为荧光探针，二者浓度比为2∶3.

由图5可知Cu2+通过更强的络合能力与茜素红结合，使Al3+游离出来，荧光强度随着Cu2+浓度的增加而降低，可以选择此反应体系测定Cu2+.

2.4 反应pH及缓冲溶液用量的选择

按1.2.2的实验方法，固定其他条件不变，用HCl和NaOH调pH=3～8，测定溶液的荧光强度，并计算ΔF的值(ΔF=F0-F)，如图6所示.图6结果表明在碱性环境下，585 nm处的荧光强度很弱，体系的颜色也发生变化.在酸性条件下荧光强度随着pH的增大先增大后减小，在pH=5时ΔF最大，用酸度计确定pH=5.2.配制pH=5.2的HAc-NaAc缓冲溶液，测定缓冲溶液的最佳用量，结果如图7.由图7可知，缓冲溶液最佳用量为3 mL.

图6 pH对反应体系ΔF的影响Fig.6 Effect of pH on reaction system ΔF

图7 HAc-NaAc缓冲溶液的用量Fig.7 Amount of HAc-NaAc buffer solution

2.5 反应温度和时间的选择

按1.2.2的实验方法，固定其他条件不变，只改变反应温度为30、40、50、60、70 ℃，测定溶液的荧光强度，并计算ΔF的值(图8)；固定其他条件不变，只改变反应时间为5、10、15、20、25、30 min，测定溶液的荧光强度，并计算ΔF的值(图9).

图8 温度对反应体系ΔF的影响Fig.8 Effect of temperature on reaction system ΔF

图9 时间对反应体系ΔF的影响Fig.9 Effect of time on reaction system ΔF

图8表明，随着温度的升高ΔF先增大后减小，当温度达到30 ℃时，ΔF最大，之后随着温度的升高而降低，故选30 ℃为最佳反应温度.图9表明，随着时间的增加ΔF先增大后减小，当反应时间为10 min时，ΔF最大，反应最佳.

2.6 工作曲线及检出限

配制一系列不同浓度的Cu2+溶液，按实验方法分别进行荧光光谱扫描，结果见图10、图11.结果表明：Cu2+浓度在0.2～30 μmol/L时与ΔF呈良好的线性关系.其线性回归方程为ΔF=19.7c+101.2，R2=0.999 5.对5 μmol/L的Cu2+溶液，平行测定6个样品，其相对标准偏差为0.10.将空白溶液平行测定11次，用公式3S/K求得检出限为0.022 μmol/L.

图10 不同浓度的Cu2+猝灭的荧光光谱Fig.10 Fluorescence spectra of Cu2+ quenched complexes with different concentrations

图11 工作曲线Fig.11 Work curve

2.7 干扰离子的影响

2.8 样品分析

分别取2种水样，再加入适量六偏磷酸钠除去水中铁离子，最后用少量活性炭除去水中其他少量杂质并过滤.取滤液2 mL置于25 mL比色管，按1.2.2的实验方法配制溶液，测定荧光强度ΔF.结果如表1.

表1 样品及回收率的测定(n=6)

由表1可知，实际样品测定回收率为99.3%～101%.取同样的自来水，用原子吸收法和荧光猝灭法进行测定，结果分别为(1.26±0.021)μmol/L和(1.25±0.012)μmol/L.两者比较，经t检验，两者无统计学意义.

3 结论

本文在pH=5.2下，Cu2+可以猝灭Al3+与茜素红络合物的荧光，建立了一种“开关式”测定Cu2+的新方法，此方法测定Cu2+的工作曲线为ΔF=19.7c+101.2，R2= 0.999 5,线性为0.2～30 μmol/L，检出限0.022 μmol/L.与国标原子吸收光谱法比较没有显著性差异，该方法具有灵敏度高、背景值低、操作简单、方便等优势，能更好地适用于水质监测，与其他方法相比更先进，更有应用价值.