醌茜素抑制PI3K通路的磷酸化对宫颈癌CaSki细胞凋亡和自噬的影响

王华斌，干晓琴，丁勇利，李永文，刘智涛，李玥桦

宫颈癌是一种妇科生殖道恶性肿瘤，主要由于高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)持续感染所致。目前已成为危害全球女性健康的重大疾病，且新发病率和死亡率还在持续上升[1-2]。宫颈癌中鳞状细胞癌占比高达75%～80%，而鳞状细胞癌中HPV16基因型最多见。研究[3]表明宫颈癌Caski细胞含有完整的HPV16型基因，因而对其进行研究并找到控制方法意义重大。醌茜素即1,2,5,8以-四羟基蒽酮(1,2,5,8-tetrahydroxyanthraquinone，Quinalizarin)是一类蒽醌类化合物，主要存在于鼠李科植物翼核果内[4]。研究[5]表明醌茜素能抑制人肝癌Huh7细胞增殖和存活，诱导细胞凋亡。较高浓度的醌茜素能够有效抑制人肺癌A549细胞增殖并诱导其凋亡，可能成为靶向治疗非小细胞肺癌的新型药物[6-7]。但醌茜素对宫颈癌的作用却少有报道，该文旨在探究醌茜素对宫颈癌Caski细胞凋亡和自噬的影响及其作用机制，从而为宫颈癌治疗提供可能的参考方向。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器SPF级C57BL/6雄性小鼠(6～8周龄，体质量20～25 g),购自四川省人民医院实验动物研究所，许可证号：SCXK(川)2018-15；人宫颈癌Caski细胞(中国典型培养物保藏中心)。RPMI 1640培养基、四季青胎牛血清、醌茜素(德国MERCK公司),BrdU、5-氟尿嘧啶(上海皓元生物医药科技有限公司)，胰蛋白酶、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(美国Sigma公司)，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)，3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)(广州华大基因科技有限公司)，兔来源Actin、Ki67、ATG5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、AKT、p-AKT、PI3K、mTOR、p-PI3K、p-mTOR、Cleaved caspase-3、caspase-3、LC3单克隆抗体(美国CST公司)，FACS Calibur型流式细胞测定仪(美国Becton-Dickinson公司)，激光共聚焦显微镜(FV3000)(日本奥林巴斯公司)。

1.2 细胞培养宫颈癌Caski细胞贴壁培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，每1～2 d换液1次，本实验中均使用对数生长期的细胞。

1.3 BrdU染色观察细胞增殖在细胞密度达到50%～60%时，加入BrdU(1 mg/ml)，37 ℃孵育48 h。弃培养液，玻片用PBS洗涤3次，4%PFA固定30 min。固定好的玻片用PBS洗涤3次，于2 mol/L HCl中37 ℃变性5 min。用0.1 mol/L的硼酸钠(pH=8.3)中和10 min，PBS洗涤3次。加入1 ml Triton X-100，浸泡10 min后吸出再用PBS洗涤3次。加入1 ml 3%的BSA封闭，于室温放置1 h后吸出再用PBS洗涤3次。加入一抗即抗小鼠BrdU单抗，用1%BSA稀释，4 ℃过夜后用PBS洗涤3次。细胞核用DAPI染色。之后在显微镜观察细胞数量变化及BrdU阳性细胞数。

1.4 流式细胞仪检测宫颈癌Caski细胞凋亡方法来自其使用说明书。凋亡率用Annexin-V 阳性细胞数占总细胞数的百分比表示。

1.5 Western blot检测增殖、凋亡、自噬以及PI3K通路磷酸化相关蛋白的表达收集细胞，用生理盐水洗涤2次，然后用含有蛋白酶抑制剂RIPA裂解缓冲液裂解，提取总蛋白并测定浓度。取30 μg，用5×buffer上样12%SDS-PAGE电泳分离，然后移到硝酸纤维素膜上，用脱脂乳封闭1 h，敷上相应的兔来源单克隆抗体(Actin 1 ∶1 000、Ki67 1 ∶1 000、ATG5 1 ∶1 500、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 1 ∶2 000、p62 1 ∶1 000、AKT 1 ∶800、p-AKT 1 ∶1 000、PI3K 1 ∶1 000、mTOR 1 ∶1 000、p-PI3K 1 ∶1 000、p-mTOR 1 ∶1 000、Cleaved caspase-3 1 ∶1 000、caspase-3 1 ∶1 000)在4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5次，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔单克隆二抗(1 ∶2 000)孵育1 h后，化学发光检测。

图1 不同浓度醌茜素处理对宫颈癌CaSki细胞增殖能力的影响 A：BrdU染色观察细胞增殖×100；B：BrdU阳性细胞所占比例统计；C：Western blot检测增殖标记蛋白Ki67表达；1：对照组；2：醌茜素1 μmol/L组；3：醌茜素4 μmol/L组；4：醌茜素12 μmol/L组；5：5-氟尿嘧啶组；与对照组比较：*P<0.05

图2 不同浓度醌茜素处理对宫颈癌CaSki细胞凋亡的诱导作用 A：流式检测细胞凋亡情况；B：Western blot检测凋亡标记蛋白Cleaved caspase-3表达；C：凋亡标记蛋白Cleaved caspase-3表达统计；1：对照组；2：醌茜素1 μmol/L组；3：醌茜素4 μmol/L组；4：醌茜素12 μmol/L组；5：5-氟尿嘧啶组；与对照组比较：*P<0.05

1.6 免疫荧光检测LC3的含量和AKT的细胞膜阳性定位情况将细胞接种于玻片上，处理后，用PBS洗涤3次，每次3 min。用4%PFA固定15 min，PBS浸洗3次；然后用0.5%Triton X-100室温通透10 min，PBS浸洗3次，用5%BSA于室温下封闭45 min后，滴加相应兔来源单克隆抗体(LC3 1 ∶2 000、AKT 1 ∶1 000)于4 ℃过夜孵育。PBS清洗3次，滴加相应的荧光二抗，湿盒中20～37 ℃孵育1 h，用PBS进一步洗涤3次后。细胞核用DAPI染色。然后在激光共聚焦显微镜上观察。

1.7 构建移植瘤裸鼠模型并进行体内实验在若干只裸鼠的右前部背部皮下注射细胞密度为5×109/L 的CaSki细胞，筛选出正常形成移植瘤的小鼠。体内实验设置两组，一组为裸鼠模型组，另一组为移植瘤加药组(灌胃醌茜素30 mg/kg[8])。一段时间后处死裸鼠，皮下剥离肿瘤组织，观察其形态并称重。

1.8 免疫组化检测Ki67、Caspase-3、ATG5的表达肿瘤标本用10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片并用苏木精-伊红染色和EnVision两步法进行免疫组化染色。将切片进行常规脱蜡至水，用pH 8.0 的1 mmol/L EDTA缓冲液高压修复抗原，加入兔来源单克隆抗体(KI67 1 ∶1 000、Caspase-3 1 ∶1 000、ATG5 1 ∶800)4 ℃过夜孵育，用Dako Rubbit/Mouse EnVision/HRP复合物室温孵育40 min，DAB镜下显色，苏木精衬染，常规脱水至透明，中性树胶封片，于显微镜下观察并统计阳性细胞数量。

2 结果

2.1 醌茜素能够抑制宫颈癌CaSki细胞增殖对宫颈癌CaSki细胞用不同浓度(0、1、4、12 μmol/L)的醌茜素处理，以5-氟尿嘧啶组(5 μmol/L)作为阳性对照。经过BrdU染色显示，宫颈癌CaSki的BrdU阳性细胞率随着醌茜素浓度增加而逐渐减弱(图1A、B)，差异有统计学意义(F=32.234，P=0.004)；对标记细胞增殖状态的抗原蛋白Ki67进行定量检测，显示其表达量随着醌茜素浓度增加而明显降低(图1C)，差异有统计学意义(F=15.422，P=0.008)；说明醌茜素能够抑制宫颈癌CaSki细胞增殖。

2.2 高浓度醌茜素能够诱导宫颈癌CaSki细胞发生凋亡从流式细胞检测结果来看，以0、1、4、12 μmol/L醌茜素和5-氟尿嘧啶处理同一状态的宫颈癌CaSki细胞后，细胞凋亡率分别为(13.62±4.16)%、(17.36±4.21)%、(23.73±4.35)%、(38.82±5.06)%、(44.42±5.12)%，差异有统计学意义(F=28.674，P=0.005)。Western blot结果显示，促凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表达水平随着醌茜素浓度增加而不断升高，差异有统计学意义(F=21.205，P=0.006)。说明高浓度醌茜素能够诱导宫颈癌CaSki细胞发生凋亡。见图2。

2.3 高浓度醌茜素能促进宫颈癌CaSki细胞自噬为了检测不同浓度醌茜素对宫颈癌CaSki细胞自噬的影响，采用0、1、4、12 μmol/L醌茜素处理细胞，分别检测自噬标记分子ATG5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及自噬底物p62变化。结果如图3A显示ATG5的表达水平随醌茜素浓度增加而逐渐降低，而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值却是逐渐增大，p62的表达量逐渐增多，差异有统计学意义(F=25.346，P=0.006；F=16.154，P=0.008；F=15.142，P=0.009)。因此醌茜素能够促进宫颈癌CaSki细胞自噬。免疫荧光检测LC3的含量结果如图3B所示：对照组、醌茜素12 μmol/L组、 3-MA组、3-MA+醌茜素12 μmol/L组单个细胞LC3斑点数分别为(3.12±0.16)、(29.33±0.87)、(1.02±0.12)、(6.45±0.67)，差异有统计学意义(F=85.34，P=0.000)。Western blot检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达情况，如图3C所示，组间差异有统计学意义(F=41.183，P=0.003)。单独用自噬抑制剂3-MA处理后，显示细胞自噬明显被抑制，而当12 μmol/L醌茜素和3-MA联合处理Caski细胞时，自噬作用又恢复了，表明高浓度醌茜素确实能促进宫颈癌CaSki细胞自噬。

图3 不同浓度醌茜素和3-MA处理对宫颈癌CaSki细胞自噬的影响 A：Western blot检测自噬标记分子ATG5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及自噬底物p62表达水平；B：免疫荧光检测LC3的含量 ×400 ；C：Western blot检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平；1：对照组；2：醌茜素12 μmol/L组；3：3-MA组；4：3-MA+醌茜素12 μmol/L组；与对照组比较：*P<0.05；与3-MA组比较：#P<0.05

图4 3-MA与高剂量醌茜素处理对宫颈癌CaSki细胞PI3K通路磷酸化的影响

2.4 醌茜素通过抑制PI3K通路蛋白磷酸化以促进宫颈癌CaSki细胞自噬和凋亡为了探索醌茜素对宫颈癌CaSki细胞的促进自噬和凋亡的作用机制，Western blot测定其PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平。如图4A所示，组间PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平有统计学意义(F=14.136，P=0.09；F=8.923，P=0.012；F=12.312，P=0.010)。用高浓度(12 μmol/L)醌茜素单独处理宫颈癌CaSki细胞后，能够抑制PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化，而单独使用3-MA会促进其磷酸化，二者联合使用时这些蛋白磷酸化水平又降低，说明醌茜素能够逆转3-MA对PI3K通路磷酸化的促进作用，进而促进CaSki细胞自噬。而后通过免疫荧光检测抗凋亡蛋白AKT的细胞膜阳性定位(图4B)，显示醌茜素同样可以恢复3-MA的促进AKT的表达效应，从而促进宫颈癌CaSki细胞凋亡。综上说明醌茜素可以通过抑制PI3K通路蛋白磷酸化来促进宫颈癌CaSki细胞自噬和凋亡。

2.5 构建移植瘤裸鼠模型进行体内实验对照组和醌茜素30 mg/kg组移植瘤重量分别为(0.28±0.07)、(0.10±0.04)g，差异有统计学意义(t=2.912，P<0.05)。通过免疫组化检测2组鼠内Ki67、Caspase-3、ATG5的表达，显示移植瘤裸鼠加药组中Ki67、ATG5的表达量比对照组少，而Caspase-3的表达量比对照组高，差异有统计学意义(t=4.238，P<0.05；t=2.279，P<0.05；t=3.167，P<0.05)，表明醌茜素能在裸鼠体内抑制宫颈癌CaSki细胞的增殖，能促进宫颈癌CaSki细胞凋亡和自噬。对2组鼠内PI3K、AKT、mTOR的磷酸化情况进行检测，显示移植瘤裸鼠加药组中PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平降低，差异有统计学意义(t=9.123，P<0.05；t=11.642，P<0.05；t=8.642，P<0.05)，表明在裸鼠体内醌茜素可能是通过抑制PI3K通路蛋白磷酸化来促进宫颈癌CaSki细胞凋亡和自噬的，与上面的体外实验结果一致。

图5 对移植瘤裸鼠加药处理后各项指标变化情况 A：移植瘤图片；B：免疫组化检测Ki67、Caspase-3、ATG5表达水平；C：免疫组化检测Ki67、Caspase-3、ATG5表达水平×200；D：Western blot检测PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平；与对照组比较：*P<0.05

3 讨论

近几年来宫颈癌对于全球女性健康的危害日益严峻，找到有效、高效治疗方法已经是迫在眉睫。目前对于宫颈癌的治疗最首选的方法是通过药物化疗，然而临床上常用的抗肿瘤药物多有毒副作用大、价格较高的缺陷，因此从中药中挖掘高效低毒、容易获取、价格低廉的抗癌活性成分是目前医学领域的研究热点。研究[7,9-11]发现醌茜素对肝癌、肺癌、胃癌等细胞均具有抑制增殖、诱导凋亡的作用，而且价格低廉，毒副作用较小，是很好的研究材料。本实验通过一系列细胞生物学、分子生物学、体内实验等途径证明了醌茜素对宫颈癌Caski细胞具有促凋亡和自噬的作用，并初步探索推测可能是通过抑制PI3K通路的磷酸化来发挥作用的。

细胞凋亡是生物体内自发调节的细胞死亡方式，它的正常运行对于人体各项生命活动具有重要作用[12]。肿瘤的发生是细胞正常增殖能力改变和凋亡失衡的复杂综合表现[13]。本实验中用不同浓度的醌茜素处理宫颈癌Caski细胞，显示醌茜素能够抑制宫颈癌CaSki细胞增殖，并且表现为明显的浓度依懒性。经过流式细胞仪检测，表明醌茜素能够诱导宫颈癌CaSki细胞发生凋亡，并且随着浓度升高，细胞凋亡率也是逐渐上升。经过Western blot检测，显示Ki67和caspase-3的表达量变化也与醌茜素的浓度呈依懒性，从而进一步说明醌茜素能够抑制宫颈癌CaSki细胞增殖和诱导其凋亡。这一点与之前对胃癌、肺癌、肝癌细胞的影响是一致的[5-6]。

自噬是生物体内一个实现细胞自身代谢需求和细胞器更新的高度保守的自然生理现象。通过检测用不同浓度醌茜素处理的宫颈癌CaSki细胞内ATG5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及自噬底物p62的变化，显示醌茜素能够促进宫颈癌CaSki细胞自噬。之后用自噬抑制剂3-MA和高浓度(12 μmol/L)醌茜素单独或联合处理宫颈癌CaSki细胞，并检测其LC3的含量和斑点数量以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，表明高浓度醌茜素能够扭转3-MA的自噬抑制作用，进一步证明高浓度醌茜素能诱导宫颈癌CaSki细胞自噬。用不同浓度醌茜素处理的宫颈癌CaSki细胞时，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值是逐渐增大，自噬底物p62的表达量也是逐渐增多的，这说明醌茜素的浓度升高可能导致宫颈癌CaSki细胞自噬小体降解过程受到抑制，也就是说高浓度醌茜素会抑制宫颈癌CaSki细胞自噬下游进程。

有研究[14]表明，PI3K/AKT/mTOR信号通路涉及多项细胞活动，包括细胞存活、细胞增殖、代谢及细胞凋亡等，而且在肿瘤细胞的增殖、自噬、转移及存活上有重要调控作用。本实验中为了探索醌茜素是否是通过抑制PI3K通路磷酸化来抑制宫颈癌CaSki细胞自噬和凋亡，对用高浓度(12 μmol/L)醌茜素和3-MA单独或联合处理的宫颈癌CaSki细胞内的PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平进行检测，加上AKT的细胞膜阳性定位结果，表明醌茜素可能是通过抑制PI3K通路蛋白磷酸化来促进宫颈癌CaSki细胞自噬和凋亡。另外，有研究[15]表明沉默CD276基因的表达能明显抑制宫颈癌Caski细胞的增殖,促进其凋亡，作用机制可能与白细胞介素-8、血管内皮生长因子的蛋白水平有关，那么醌茜素对CD276基因的表达是否有影响，还需要进一步研究。