血浆外泌体miR-1183在结直肠肿瘤中的表达及诊断价值研究

张士龙，吴文涌

我国结直肠癌综合发病率和病死率分别排第三和第五位，总体呈现持续上升趋势[1- 2]。超过半数的临床首诊患者因出现了转移而错过最好诊疗时段，导致预后不佳。因此，探寻有效的结直肠肿瘤早期预警标志对患者预后和生存状况的改善具有重要价值。外泌体被称为肿瘤进展的"探路者"，在肿瘤进展全过程均扮演重要角色[3]。外泌体 miRNAs 在血液中稳定性好、丰度较高，在肿瘤早筛早诊、疾病监测、疗效评价等方面具有强大的标志物潜能。miR-1183在多种肿瘤中均有研究[4-7]，但miR-1183在结直肠癌血液外泌体中的表达及临床价值尚不清楚。该实验通过测定结直肠癌、结直肠腺瘤和健康对照3组血浆样本中外泌体miR-1183的表达情况，检验其表达水平与临床病例特征的相关性，旨在对外泌体miR-1183在结直肠肿瘤中的诊断价值进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 病例资料血液样本来源于2018年6月—2019年12月安徽医科大学第一附属医院高新院区胃肠外科一病区收治的80例结直肠癌患者。男性44例，女性36例，年龄36～81(57.33±12.46)岁；0～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期41例。患者均是首诊未治，病理确诊为结直肠癌，无其他重大疾病和肿瘤，样本采集于术前。70例结直肠腺瘤和70例健康血样本分别收集于内镜室和体检部门。此研究经安徽医科大学第一附属医院伦理委员会的审批，参与者均签有知情同意书。

1.2 血浆样本的采集EDTA抗凝管采集外周静脉血10 ml，通过4 ℃离心机3 500 r/min，10 min离心处理，血浆转至Eppendorf 管后储存于-80 ℃冰箱。

1.3 血液外泌体提取与鉴定

1.3.1提取 使用0.22 μm滤器过滤血浆样本；按照exoEasy Maxi Kit试剂盒(Qiagen，美国)操作手册规范提取血浆外泌体。其应用膜亲和性原理，用特定的 XBP 缓冲液与等体积血浆进行混合稀释，于 exoEasy离心柱内离心，所得液体10 ml XWP缓冲液洗涤，最后使用400 μl XE缓冲液孵育，2次洗脱，离心获得外泌体液。

1.3.2透射电子显微镜及纳米粒径分析(nanoparticle tracking analysis，NTA) 备外泌体液，吸取样本5～10 μl 滴加于铜网，沉淀3 min，在滤纸边缘处吸去浮液；常温干燥2 min，通过JEM-1200EX透射电子显微镜(日本电子株式会社)成像观察。NTA于广州表观生物科技有限公司进行检测并分析。

1.3.3流式分析 使用100 μl外泌体液，密封冰上保存；将不染色外泌体的样品设为阴性对照，记为NC；样品分别以CD63和CD81抗体进行染色，记为CD63和CD81；按照BD accuri C6 flow cytomenter仪器操作规范上机检测。

1.4 外泌体RNA提取及qRT-PCR检测按照exoEasy Maxi Kit试剂盒提取血浆外泌体总RNA，NanoDrop 2000检测RNA 浓度。取2 μl总RNA作为模板，按照miScript ll RT Kit试剂盒进行逆转，再以miScript SYBR Green PCR Kit进行扩增。逆转录miRNA引物由上海吉玛设计(miR-1183：RT 引物：5′-CACTGTAGGTGATGGTGAGAGTGGCA-3′，PCR引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′)；外参miR-39-1(Spike-In Control购自Qiagen，美国)。应用2-ΔCt法计算miR-1183的相对表达量，ΔCt=CtmiR-1183-CtmiR-39-1。

2 结果

2.1 血浆外泌体提取和鉴定通过透射电子显微镜、流式分析和NTA对提取的血浆外泌体特性进行鉴定。在透射电镜下放大196 000倍后观察提取的1例结直肠癌患者和1名健康对照者的血浆外泌体，可见提取到的血浆外泌体为茶托样双层脂质膜结构，大小均<200 nm(图1A)；CD63 和CD81为定位于外泌体膜上的蛋白标志物，经流式分析1例肿瘤样品中CD63和CD81两个表面蛋白的表达情况，经检测2个蛋白均有阳性信号，阳性率分别为50.5%和85.1%(图1B) ；NTA示外泌体粒径为95～265 nm，在145 nm处富集，对其定量后浓度约为3.55×109个颗粒/ml(图1C) 。

2.2 血浆外泌体miR-1183表达水平分析qRT-PCR对80例结直肠癌患者、70例结直肠腺瘤患者和70例健康对照者的血浆外泌体miR-1183水平进行检测。以Kruskal-Wallis检验分析3组血浆外泌体miR-1183的表达差异，结果显示差异具有统计学意义(P<0.000 1)。以Mann-Whitney U检验分析2组血浆外泌体之间miR-1183的表达差异，结果显示，血浆外泌体miR-1183的表达水平在癌组高于健康对照组(P<0.000 1)，腺瘤组亦高于健康对照组(P=0.001 8)，并且在癌组也高于腺瘤组(P<0.000 1)(图2)。

图1 血浆外泌体的鉴定

2.3 血浆外泌体miR-1183表达和临床特征相关分析Mann-Whitney U 检验对结直肠癌血浆外泌体miR-1183的表达与临床特征间相关性进行分析，结果表明结直肠癌血浆外泌体 miR-1183的表达与病理分期、N分期、M分期、血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)水平相关，而与患者年龄、性别、T分期、分化程度、病灶位置和部位无相关(表1)。同法分析结直肠腺瘤血浆外泌体miR-1183的表达与临床特征的相关性，结果显示结直肠腺瘤血浆外泌体 miR-1183表达与患者的血清CEA水平呈正相关，而与患者年龄、性别、病灶位置和部位无相关(表2)。

图2 qRT-PCR检测miR-1183在健康对照组、结直肠腺瘤者、结直肠癌者血浆外泌体中的表达水平与健康对照组比较：**P<0.01，***P<0.001

2.4 血浆外泌体miR-1183对结直肠肿瘤的诊断效能ROC曲线结果表明，血浆外泌体miR-1183鉴别结直肠癌患者和健康者的95%CI为0.829 9～0.941 5(P<0.000 1)，灵敏度为78.75%，特异度为84.29%，截断值为0.023 2；鉴别腺瘤患者和健康者的95%CI为0.742 1～0.886 9(P<0.000 1)，灵敏度为68.57%，特异度为84.86%，截断值为0.020 1。鉴别结直肠肿瘤患者和健康者的95%CI为0.795 2～0.909 7(P<0.000 1)，灵敏度为74.00%,特异度为84.09%，截断值为0.022 9；鉴别结直肠良恶性肿瘤的95%CI为0.650 1～0.810 6(P<0.000 1)，灵敏度为47.5%，特异度为91.43%，截断值为0.040 4。见图3。

3 讨论

尽早发现和干预是有效提高结直肠肿瘤患者生存预后的关键。在中国，结直肠肿瘤常规筛查仍未普及，通常应用粪便潜血试验、问卷调查等方法进行初筛，结肠镜作为二次筛查[8]。在郑树教授等人发表的《中国大肠癌流行病学及其预防和筛查白皮书》中提到，我国结直肠癌早诊率只有5%～10%，60%以上的患者初诊时已经是Ⅱ期或晚期。由此可见，我国结直肠肿瘤筛查工作还有待提升和加强。

循环miRNAs的主要来源是被囊泡包裹稳定存在的miRNAs[9]，这种囊泡被认为可由所有的细胞(包括肿瘤细胞)分泌，外泌体是30～150 nm大小的囊泡，它包含供体细胞的DNA、mRNA、各类ncRNA、蛋白质、脂类物质等活性分子, 研究[10-11]表示肿瘤来源的外泌体在触发肿瘤转移机制、重塑肿瘤转移微环境、协助肿瘤免疫逃逸等方面扮演了重要角色。血浆外泌体miRNAs等为代表的液体活检新技术和分子层面个体化筛查策略是未来重要的发展方向，有望完善结直肠肿瘤的临床筛查指南[12]。

表1 miR-1183在结直肠癌血浆外泌体中表达水平与临床病理特征的相关性

表2 miR-1183在结直肠腺瘤血浆外泌体中表达水平与临床特征的相关性

图3 ROC曲线分析血浆外泌体miR-1183分别对结直肠癌、结直肠腺瘤、结直肠肿瘤和结直肠良恶性肿瘤的诊断或鉴别潜能A：结直肠癌；B：结直肠腺瘤；C：结直肠肿瘤；D：结直肠良恶性肿瘤

该研究旨在对外泌体miR-1183在结直肠肿瘤中的诊断价值进行初步探讨。第一步纯化的血浆外泌体，对其特性进行鉴定。其次，通过 qRT-PCR 分析外泌体miR-1183的表达情况，显示结直肠肿瘤患者血浆外泌体miR-1183的表达与健康组相比上调，AUC为0.852 5，表明 miR-1183对结直肠肿瘤具有较高的诊断效能。结直肠良恶性肿瘤组与健康组相比显示，血浆外泌体miR-1183在肿瘤早-晚期各阶段中的表达呈现梯度上调指向，其对结直肠癌和腺瘤的AUC 结果分别为0.885 7和0.814 5。其在鉴别结直肠良恶性的0.730 4，95%CI为0.650 1～0.8106。均具有较高的诊断效能。此外，在分析结直肠肿瘤患者中miR-1183的表达与临床特征关系时，显示结直肠癌血浆外泌体 miR-1183表达与病理分期、N分期、M分期、血清CEA水平相关，提示miR-1183的表达与结直肠癌的疾病进展相关，血浆外泌体miR-1183具有作为结直肠肿瘤辅助或分层诊断的指标。

综上，本研究表明血浆外泌体miR-1183可能成为结直肠肿瘤早期预警标志物。该研究为临床结直肠肿瘤(特别是腺瘤阶段)的筛查和诊断提供了无创、简便而有效的新方向，其灵敏性和特异性与传统的粪便潜血试验、CEA标志物等项目比较，有了极大的提高[14-15]。此次研究也有许多不足之处: ① 样本入组时间较近，无法获得入组患者随访信息，从而未能进行生存分析及预后风险评估; ② 未进一步探索的外泌体miR-1183在结直肠肿瘤中可能涉及的功能及机制。③ 样本量相对小，不能排除个体差异的隐性影响[16]。若要开发血浆外泌体miR-1183作为分子指标应用于临床，仍需扩大样本，进行多中心更深入的研究。此外，需要进一步完善血液外泌体相关的实验方法和理论，深入探讨血浆外泌体miRNAs在肿瘤领域发挥的重要作用。