miR-455-3p靶向HDAC2对卵巢上皮性癌细胞生长和运动的影响

杨 娟，程国梅，董亚娜，张艳慧，龙文义

卵巢上皮癌(epithelial ovarian carcinoma，EOC)是最常见的卵巢癌组织学类型，是一种异质性疾病[1]。目前用于治疗大多数晚期卵巢癌患者的护理标准涉及细胞减灭术和铂类化学疗法，尽管许多接受初次化疗的患者反应率很高，但大多数晚期卵巢癌患者最终都会发展出对化疗有抵抗力的复发性疾病[2]。因此，鉴定敏感的，非侵入性的生物标志物以改善早期发现并指导治疗尤为紧急。微小RNA(MicroRNA，miRNA在各种类型的人类癌症中可充当癌基因或抑癌基因[3]。miR-455-3p在多种肿瘤中低表达，作为抑癌基因参与调控各种生物进程，包括细胞增殖、凋亡、迁移及药物抗性等[4-5]。已有研究[6]表明miR-455-3p通过靶向调控转脂蛋白4抑制卵巢癌细胞SKOV-3的增殖、迁移及上皮间质转化。然而miR-455-3p在卵巢上皮癌中的作用尚不明确。该文旨在研究miR-455-3p通过靶向HDAC2对卵巢上皮性癌细胞生长和运动的影响。

1 材料与方法

1.1 试验试剂Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640)培养基、胎牛血清、青-链霉素、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；BRDU细胞增殖检测试剂盒、LipoRNAiTM转染试剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；荧光素酶检测试剂盒购自北京solarbio公司；Transwell购自美国Corning公司；Ki67、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、波形蛋白(Vimentin)、纤维粘连蛋白(Fibronectin)购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养人卵巢癌细胞HO-8910来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，将细胞培养于RPMI1640培养基中，添加10%胎牛血清和1%青-链霉素，置于37 ℃含5%CO2的培养箱中培养，每24 h更换新鲜培养基，1 ∶2传代。选用对数生长期细胞为实验用细胞。

1.3 细胞转染与分组构建HDAC2 pcDNA载体过表达HDAC2，细胞转染mimic，将细胞随机分为4组：Control组、mimic组、HDAC2组、mimic+HDAC2组。

1.4RT-PCR取对数生长期HO-8910细胞，将细胞分为3组：Control组、scramble组和mimic组，Control组不做处理，scramble组转染mimic-NC，mimic组转染miR-455-3p mimic检测miR-455-3p、HDAC2表达水平。用TRIzol法从HO-8910细胞中提取总RNA,用Nanodrop分光广度计测定吸光度(A260/A280)，按照试剂盒说明书进行cDNA的合成和PCR的扩增，反应条件为:94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s，扩增35个循环; 72 ℃延长10 min;存储在4 ℃条件下。反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离。

1.5 荧光素酶报告实验为了检测HDAC2是否为miR-455-3p的直接下游靶基因，选用荧光素酶报告分析。构建野生型和突变型HDAC2 3、UTR荧光素酶报告基因质粒。用PBS清洗，倒去洗涤液，加入1×ULB，在微型振荡器中混匀5 min， 按照试剂盒说明进行荧光素酶活性检测。

1.6 BrdU染色将转染后细胞传代接种于6孔板内，待细胞融合率达80%时，用含0.4%FBS的培养液同步化孵育72 h。加入终浓度为0.03 μg/ml的BrdU继续孵育40 min。PBS洗涤细胞3次，用多聚甲醛固定10 min，严格按照说明书进行细胞增殖检测。镜下观察并计数BrdU阳性细胞数。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡收集悬浮细胞到10 ml的离心管中，每样本细胞数为3×106/ml，1 000 r/min离心5 min，弃去培养液，用孵育缓冲液洗涤1次，1 000 r/min离心5 min，用100 μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育15 min，1 000 r/min离心5 min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次，加入SA-FLOUS溶液4 ℃下孵育20 min，避光并不时振动，流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488 nm，用波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检测PI。

1.8 Transwell实验将各组细胞分别接种于Transwell上室，下室为含10%胎牛血清的完全培养液，培养36 h后，苏木精染色封片，测定穿过孔的细胞数目。

1.9 划痕试验检测细胞迁移使用marker笔在细胞培养板做划线处理，然后在画线后的细胞培养板中培养各组细胞，待细胞铺满时，利用枪头垂直于所画横线进行划痕。划痕后用PBS洗涤细胞培养板，再加入无血清的培养液继续培养细胞。于0和24 h取样并拍照，划痕闭合率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.10 Western blot实验收集各组细胞在冰上溶解25 min。以12 000 r/min离心10 min，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，用BCA试剂盒测定蛋白质含量。提取等量的蛋白质样品(20 mg)，在100 ℃条件下变性5 min。然后使用SDS-PAGE凝胶电泳法分离并转移至PVDF膜，在4 ℃条件下加入相应一抗(1 ∶1 000)并孵育过夜，清洗，然后在4 ℃下加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶10 000)，孵育2 h，最后加入发光液，曝光处理。ImageJ软件统计灰度值。

2 结果

2.1 miR-455-3p与HDAC2靶向关系通过生物信息学软件TargetScan对miR-455-3p和HDAC2的靶向关系进行预测。显示miR-455-3p与HDAC2存在碱基结合位点，结果如图1A所示，说明miR-455-3p是HDAC2的靶向调节基因之一。转染mimic后，采用RT-PCR检测miR-455-3p、HDAC2表达水平结果如图1B、C所示，与Control组比较，mimic组miR-455-3p表达水平升高(F=376.32，P<0.05)，HDAC2表达水平降低(F=1452，P<0.05)；为明确miR-455-3p对HDAC2的靶向关系，采用荧光素酶实验检测，HDAC2 wt加入miR-455-3p mimic处理后荧光素酶活性极降低(F=14.18,P<0.05，图1D)，结果证明miR-455-3p和HDAC2存在直接靶向作用关系。

图1 miR-455-3p与HDAC2靶向关系

2.2 miR-455-3p靶向HDAC2抑制卵巢癌细胞HO-8910增殖构建HDAC2 pcDNA载体，RT-PCR检测HDAC2表达水平结果如图2A所示，与Control组比较，pcDNA-HDAC2组HDAC2表达水平升高(F=75，P<0.05)；通过BrdU染色检测各组细胞增殖结果如图2B、C所示，与Control组比较，mimic组BrdU阳性细胞数降低(F=77.631，P<0.05)，HDAC2组BrdU阳性细胞数升高(F=24.415，P<0.05)，mimic+HDAC2组BrdU阳性细胞数低于HDAC2组(F=28.605，P<0.05)。

2.3 miR-455-3p靶向HDAC2促进卵巢癌细胞HO-8910凋亡通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡结果如图3所示，与Control组比较，mimic组细胞凋亡率升高(F=60.736，P<0.05)，HDAC2组细胞凋亡率降低(F=0.692，P<0.05)，mimic+HDAC2组细胞凋亡率高于HDAC2组(F=12.78，P<0.05)。

2.4 miR-455-3p靶向HDAC2降低卵巢癌细胞HO-8910 Ki67、PCNA、c-Myc mRNA水平通过RT-PCR检测各组细胞Ki67、PCNA、c-Myc mRNA水平结果如表1所示，与Control组比较，mimic、HDAC2组Ki67(F=14.724、239.188)，PCNA(F=18.321、660.453)，c-Myc(F=56.163、377.893) mRNA水平升高(P<0.05)，mimic+HDAC2组Ki67(F=59.063)，PCNA(F=146.97)，c-Myc(F=30.253) mRNA水平低于HDAC2组(P<0.05)。

表1 miR-455-3p靶向HDAC2对卵巢癌细胞HO-8910 Ki67、PCNA、c-Myc mRNA水平的影响

图2 miR-455-3p靶向HDAC2对卵巢癌细胞HO-8910增殖的影响

图3 miR-455-3p靶向HDAC2对卵巢癌细胞HO-8910凋亡的影响 与Control组比较：*P<0.05；与HDAC2组比较：#P<0.05

2.5 miR-455-3p靶向HDAC2抑制卵巢癌细胞HO-8910侵袭通过Transwell检测各组细胞侵袭细胞数结果如图4所示，与Control组比较，mimic组侵袭细胞数降低(F=17.983，P<0.05)，HDAC2组侵袭细胞数升高(F=17.929，P<0.05)，mimic+HDAC2组侵袭细胞数低于HDAC2组(F=12.355，P<0.05)。

图4 miR-455-3p靶向HDAC2对卵巢癌细胞HO-8910侵袭的影响 ×200

2.6 miR-455-3p靶向HDAC2抑制卵巢癌细胞HO-8910迁移通过划痕实验检测各组细胞划痕愈合率结果如图5所示，与Control组比较，mimic组划痕愈合率降低(F=45.703，P<0.05)，HDAC2组划痕愈合率升高(F=3.75，P<0.05)，mimic+HDAC2组划痕愈合率低于HDAC2组(F=16.673，P<0.05)。

2.7 miR-455-3p靶向HDAC2下调卵巢癌细胞HO-8910 VEGF、Vimentin、Fibronectin蛋白水平通过Western blot检测各组细胞VEGF、Vimentin、Fibronectin蛋白表达水平结果如表2，图6所示，与Control组比较，mimic组VEGF(F=12.165)，Vimentin(F=28.604)，Fibronectin(F=53.539)蛋白水平降低(P<0.05)；HDAC2组VEGF(F=27.263)，Vimentin(F=181.62)，Fibronectin(F=134.537)蛋白水平升高(P<0.05)；mimic+HDAC2组VEGF(F=29.967)，Vimentin(F=206.929)，Fibronectin(F=100.366)蛋白水平低于HDAC2组(P<0.05)。

表2 miR-455-3p靶向HDAC2对卵巢癌细胞HO-8910 VEGF、Vimentin、Fibronectin蛋白表达水平的影响

3 讨论

上皮性卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发生发展是一个多因素、多步骤的过程，与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关。上皮性卵巢癌通常在晚期被诊断为广泛扩散的腹膜内转移，其5年生存率通常低于30%[7]。探索卵巢上皮癌的发生和发展的分子机制，确定侵袭和转移的主要因素，对卵巢上皮癌治疗和预后具有重要意义。HDAC-2是HDACs家族的成员，能促进激素和依赖细胞因子的信号转导, 并且能维持代谢平细胞周期和肿瘤形成的平衡和调节，在上皮性卵巢癌的形成中起重要作用[8]。通过生物信息学预测，显示miR-455-3p和HDAC2存在直接靶向作用关系。

图5 划痕实验检测miR-455-3p靶向HDAC2对卵巢癌细胞HO-8910迁移的影响 ×200a：Control组；b：mimic组；c：HDAC2组；d：mimic+HDAC2组;与Control组比较：*P<0.05；与HDAC2组比较：#P<0.05

图6 VEGF、Vimentin、Fibronectin蛋白表达水平

凋亡是人类癌症中一个重要的病理变化，诱导上皮性卵巢癌凋亡是治疗上皮性卵巢癌的一个重要方式。Zheng et al[9]研究发现miR-455-3p通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，在HCT116细胞中起抗癌基因的作用。Chai et al[10]研究发现miR-455-3p过表达抑制了A375细胞的增殖、迁移和侵袭，阻止了细胞周期，诱导了细胞凋亡，可作为黑色素瘤的潜在靶向治疗选择。本研究表明miR-455-3p通过靶向HDAC2具有促进卵巢癌细胞HO-8910凋亡的作用。提示miR-455-3p靶向HDAC2诱导卵巢癌细胞HO-8910凋亡。

细胞增殖在卵巢癌的临床行为和侵袭性中起重要作用。Ki67抗原的高表达与肿瘤的侵袭、血管的侵袭、肿瘤的转移、预后的保留和对化学疗法的不良反应有关。PCNA是一种细胞增殖相关蛋白，可作为上皮性卵巢癌的预后指标。c-Myc属于myc原癌基因家族，是一种核蛋白型基因，有促进细胞增殖作用，导致肿瘤形成，高表达时导致细胞增殖并诱发凋亡，在大部分恶性肿瘤中有的基因扩增和过度表达。miR-455-3p通过靶向HDAC2具有抑制卵巢癌细胞HO-8910增殖，降低Ki67、PCNA、c-Myc mRNA水平的作用。提示miR-455-3p靶向HDAC2抑制卵巢癌细胞HO-8910增殖。

侵袭和转移被认为是恶性肿瘤的最重要的生物学特征，并且是癌症治疗中的最大挑战。卵巢癌可通过直接侵袭到邻近器官或通过腹水经结肠转移而扩散[11]。Li et al[12]研究发现MicroRNA-455-3p通过靶向肿瘤抑制物EI24促进三阴性乳腺癌的侵袭和迁移。刘益娟 等[13]研究发现miR-455-3p mimics可能通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制HCT116细胞的迁移及侵袭。miR-455-3p通过靶向HDAC2具有抑制卵巢癌细胞HO-8910侵袭和迁移的作用。提示miR-455-3p靶向HDAC2抑制卵巢癌细胞HO-8910侵袭和迁移。

在卵巢肿瘤形成过程中，肿瘤细胞经历血管生成转换，在那里它们增加促血管生成因子的表达，以促进新血管系统的形成以支持肿瘤生长。血管生成的程度与疾病进展和EOC的生存期有关[14]。VEGF是最重要的血管生成开关分子之一，对内皮细胞的行为，包括迁移、增殖和分化起着重要的作用[15]。纤维粘连蛋白是存在于细胞外基质中的一种非胶原糖蛋白，与波形蛋白在上皮性肿瘤中表达增加，与肿瘤的生长、侵袭和不良预后有关，被认为是癌细胞侵袭和转移的必要条件。miR-455-3p通过靶向HDAC2具有降低卵巢癌细胞HO-8910 VEGF、Vimentin、Fibronectin蛋白表达水平的作用。提示miR-455-3p靶向HDAC2降低卵巢癌细胞HO-8910运动能力。

综上所述，miR-455-3p靶向HDAC2具有诱导卵巢癌细胞HO-8910凋亡，抑制细胞增殖、侵袭和迁移，降低运动能力的作用。说明以miR-455-3p为分子靶向治疗可作为上皮性卵巢癌的潜在生物治疗靶点。