茜素红S对扁吻鱼幼鱼的急性毒性试验

张 涛，牛建功，刘 鸿，焦 飞，张人铭，蔡林钢

(新疆维吾尔自治区水产科学研究所，农业部西北地区渔业资源环境科学观测试验站，新疆 乌鲁木齐 830000)

扁吻鱼(Aspiorhynchuslaticeps)又名新疆大头鱼，隶属鲤形目、鲤科、裂腹鱼亚科、扁吻鱼幼鱼属。本属全世界仅一种，为我国塔里木河水系的特有鱼类[1]。扁吻鱼已被列为国家一级保护水生动物[2]，在新疆被称为“水中大熊猫”。其野外种群数量分布极少，1958—1965年，博斯腾湖扁吻鱼幼鱼年产140～260 t，但已基本绝迹，目前野外种群仅分布在渭干河克孜尔水库[3]。

我国对鱼类标记放流工作十分重视，2018年在新疆开展了扁吻鱼幼鱼首次标记放流工作，标记采用方法之一为荧光药物(茜素红S)浸泡法。茜素红(Alizarin red，AR)是众多染料中的一种，属于蒽醌类化合物，被广泛用于染料、酸碱指示剂，具有较高毒性、复杂结构以及化学需氧量(COD)值大等特点，是具有代表性的染料之一[4]。茜素红S(ARS)是一种染料型配位剂，在分光光度分析方面已有了广泛的应用。茜素红S可以与钙离子配合形成沉淀[5]，沉积在骨骼中，形成荧光标记[6]；茜素红S相较于盐酸四环素及茜素络合指示剂更具价格优势，适合大规模标记使用[7]。经染色的鱼类耳石、鳍条及其他骨组织可以通过荧光显微镜发现明显的荧光标记。同时，荧光药物(茜素红S)浸泡法，是一种操作简单、对鱼体伤害小的标记方法，但过高浓度引起致死率高；因此，筛选出适宜的茜素红S标记浓度，对扁吻鱼幼鱼的标记工作具有重要的指导意义。荧光药物浸泡法标记鱼类使用广泛，目前，国内对荧光药物浸泡稀有鱼句鲫、彭泽鲫[8]、鳡鱼[9]、胭脂鱼[10]、重口裂腹鱼[11]等已有相关研究；常用水产药物对扁吻鱼幼鱼的急性毒性也已见刊[12]，但至今关于扁吻鱼幼鱼标记放流工作中荧光药物浸泡的急性毒性相关研究尚处于空白。通过设置不同浓度梯度的茜素红S溶液，准确掌握药物对扁吻鱼幼鱼的毒性影响，旨在为扁吻鱼幼鱼增殖放流中的大规模标记工作提供理论依据及数据参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用材料鱼取自新疆阿克苏地区扁吻鱼幼鱼原种场，运输至克孜尔水库管理局养殖车间暂养，7 d后挑选体表无伤、游动迅速、个体差异不大的扁吻鱼幼鱼用于试验。随机抽样25尾测得扁吻鱼幼鱼体长范围为(8.7±0.2)cm，体重范围为(5.8±0.6)g。试验期间所用养殖容器为长50 cm×宽30 cm×高30 cm的玻璃水族箱，试验前用高锰酸钾溶液进行消毒，每个容器盛水25 L，水温10℃。200 W氧气泵及材料一套，用于试验期间养殖箱中水体的增氧。

1.2 试验药品

试验所用的茜素红S(NA)(C14H7NaO7S)为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，分子量342.26，生产批号：1002637274。前期先配制成1 g/L的母液，以备后期试验使用。

1.3 试验方法

参照霍来江[13]的研究结果，为确定茜素红S浓度的大致范围，设定预试验茜素红S浓度梯度为100、200、400、800、1 000 mg/L共5个浓度组，每个浓度组放16尾扁吻鱼幼鱼，24 h后观察幼鱼状态，确定无死亡效应的茜素红S最大浓度及100%致死浓度。正式试验在无死亡效应的茜素红S最大浓度和100%致死浓度之间按照等差数列设置试验浓度梯度组和1个空白对照组，茜素红S浓度分别为0、400、500、600、700、800、900 mg/L。设置3组平行试验组，每个浓度试验箱放入16尾扁吻鱼幼鱼，在试验中，每隔4 h观察幼鱼状况，将死亡的扁吻鱼幼鱼捞出并记录数量及死亡时间。

1.4 试验数据统计及分析

试验结果统计采用平均值±标准差(Mean±SD)。

半致死质量浓度 LC50按寇氏法 (Karder)[14]求出：

Log LC50=Xm-d(∑p-0.5)

式中,Xm为死亡组最大剂量的对数；d为相邻组浓度对数差；p为各组的死亡率；∑p为各组死亡率的总和。

将茜素红S的浓度转换为浓度对数，作为横坐标；致死率作为纵坐标，用Excel 2007软件进行统计分析，拟合回归直线方程。

安全浓度SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2

式中，SC为安全质量浓度；24 h LC50和 48 h LC50分别为24 h和48 h半致死质量浓度。

2 结果与分析

2.1 扁吻鱼幼鱼的中毒症状

茜素红S对扁吻鱼幼鱼的急性中毒表现为鱼体游动出现异常，初期不时地剧烈游动、身体平衡性降低，鳃盖活动频次加快；后期扁吻鱼幼鱼游动缓慢，原地打转，体表及各鳍条沾染红色絮状物，呼吸减缓，直至丧失游动能力，沉至养殖箱底部。观察死亡的扁吻鱼幼鱼可发现各鳍条染色较重，口部微张，肛门处红肿；解剖发现死亡个体肝脏肿大且颜色发黑，肠道出现溃烂，鳃丝发暗且黏连有红色絮状物。

2.2 茜素红S对扁吻鱼幼鱼的急性毒性

不同浓度的茜素红S对扁吻鱼幼鱼的急性毒性不同，随着浓度的升高，扁吻鱼幼鱼的死亡率升高(表1)。在低浓度组400 mg/L时，扁吻鱼幼鱼未出现死亡，当茜素红S浓度为500 mg/L，72 h出现首次死亡；在中浓度组600 mg/L时，在44 h出现首次死亡，96 h死亡率为43.75%，当茜素红S浓度为700 mg/L时，首次死亡发生在24 h，死亡率为12.50%，96 h时全部死亡；在高浓度组800 mg/L时，扁吻鱼幼鱼首次死亡发生在20 h，48 h死亡率为81.25%，72 h时全部死亡，当茜素红S浓度为900 mg/L时，首次死亡发生在8 h，24 h时死亡率100%。

表1 茜素红S对扁吻鱼幼鱼的急性毒性结果

注：“—”代表该处理组全部死亡。

Note：“—”denoted all of juveniles were dead.

表2 茜素红S对扁吻鱼幼鱼的半致死浓度和安全浓度

注：y为死亡率概率单位，x为浓度对数。

Notes：ywas probit of mortality，xwas logarithm of copper ion concentration.

茜素红S质量浓度对扁吻鱼幼鱼死亡率的线性方程如图1所示，通过寇氏法公式计算出24 h的LC50值为788 mg/L，48 h的LC50值为718 mg/L，72 h的LC50值为651 mg/L，96 h的LC50值为618 mg/L。代入公式SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2，求出茜素红S对扁吻鱼幼鱼的安全浓度(SC)为179 mg/L(表2)。

3 讨论

急性毒性试验是指在24 h内动物接受药物1～2次(间歇时间为6～8 h)，动物所表现出的毒性反应。研究茜素红S对扁吻鱼幼鱼的急性毒性，能够为今后扁吻鱼幼鱼大规模药物浸泡荧光标记放流提供数据参考。

大量试验证实，鱼类的致死率与荧光标记药物浓度的升高呈现正相关性。欧阳斌等[8]在荧光物质浸泡标记稀有鱼句鲫和彭泽鲫仔、稚鱼的研究中发现，茜素络合物在浓度为30～150 mg/L(浸泡24 h)时，稀有鱼句鲫和彭泽鲫幼鱼成活率大多达到100%；在浓度为200 mg/L时，死亡率为100%。付自东等[10]在胭脂鱼荧光药物浸泡试验中，发现茜素络合物在浓度为50～200 mg/L(浸泡24 h)时，幼鱼无死亡；在浓度为250 mg/L时，幼鱼死亡率为90%。何春林等[11]在研究重口裂腹鱼时，发现茜素络合物浓度≤350 mg/L时(浸泡12 h)，幼鱼无死亡；当浓度≥400 mg/L(浸泡12 h)，幼鱼全部死亡。梁小双等[5]在研究红鳍笛鲷标记技术时，发现茜素红S浓度为100 mg/L时(浸泡36 h)，红鳍笛鲷无死亡；在浓度为600 mg/L时，红鳍笛鲷全部死亡。本试验数据表明，扁吻鱼幼鱼在茜素红S浓度为400 mg/L时(浸泡96 h)，幼鱼无死亡；在浓度为700 mg/L时，全部死亡；印证了高浓度的荧光标记药物会导致鱼类较高的致死率。

试验结果表明，茜素红S对扁吻鱼幼鱼的安全质量浓度为179 mg/L，要高于中华倒刺鲃幼鱼[13]的59.56 mg/L。根据危险化学品鱼类急性毒性分级试验方法的等级评价标准，将96 h LC50分为4级 ：96 h LC50>10.0 mg/L为低毒；1.0 mg/L<96 h LC50≤10.0 mg/L为中毒；0.1 mg/L<96 h LC50≤1.0 mg/L为高毒；96 h LC50<0.1 mg/L为剧毒[15]。茜素红S的96 h LC50为179 mg/L，故判定茜素红S对扁吻鱼幼鱼为低毒性药物，从药物毒性考虑，该荧光药物适合扁吻鱼幼鱼的标记。从扁吻鱼幼鱼的中毒症状可知，高浓度茜素红S对鱼的体表及鳃部均有较严重损伤；解剖发现其对肝胆伤害较大，故浓度过高会损害扁吻鱼幼鱼的体表黏膜及肝脏功能。茜素红S浓度为400 mg/L时，96 h未出现死亡，因此在茜素红S浸泡标记扁吻鱼幼鱼时，建议浓度设置在179～400 mg/L之间，以确保标记时用药的安全性和有效性，同时取得较好的标记效果；下一步的工作应研究恰当的标记浓度及浸泡时间，了解不同浸泡时间下的标记效果及标记色的保留时间，以期最终指导扁吻鱼幼鱼人工增殖放流中的荧光药物标记工作。