等电点沉淀法提取牡蛎蛋白及其蛋白组成分析

姜燕蓉，张亚飞，齐筱莹，王丹妮，田茂鸿，赵 慧

(大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁 大连 116623)

牡蛎(又称海蛎子)是软体动物门、瓣鳃纲、异柱目、牡蛎科的双壳贝类，是世界第一大养殖贝类，也是中国养殖产量最大的经济贝类[1]。牡蛎含有糖原、维生素、牛磺酸和铜、铁、锌等微量元素，其营养成分丰富。而且牡蛎中蛋白质含量较高，可以作为良好蛋白质来源[2-3]。但是，目前我国对牡蛎各部分的加工利用研究较少，对其蛋白质的相关性质也尚不清楚，使得牡蛎的合理加工和高值化应用受到一定的限制。

等电点沉淀法是通过在较低pH值或较高pH值条件下使蛋白质溶解，通过离心或过滤将其与不溶性物质(骨骼、皮肤或脂质)分离，然后使其在等电点下沉淀获得高含量蛋白质的过程[4]。蛋白质中的氨基酸在pH值变化时会发生一定程度的电离，导致其在溶液中的溶解度发生变化[5]。相比较盐析法、有机溶剂萃取法和酶水解法等其他蛋白质提取分离方法，等电点沉淀法具有蛋白质回收率高、蛋白质变性程度小、安全性较好等优点[6]。不同来源的分离蛋白因含有的氨基酸不同导致其溶解和沉淀pH值不相同。鱿鱼和鳙鱼蛋白在pH值为3和11的条件下溶解，当pH值为5.5时沉淀获得的分离蛋白提取率分别高达75%和79%[7-8]。在料液比1∶9、溶解pH值2.0～3.0和12.0～13.0、沉淀pH值5.5条件下，斑节对虾蛋白提取率为75.67%～82.72%[9]。

本研究以牡蛎为原料，将等电点沉淀法应用于牡蛎蛋白的制备，通过优化提取温度、溶解pH、提取时间和沉淀pH四个主要影响因素，确定牡蛎蛋白制备的最佳碱溶工艺条件，并对牡蛎中各蛋白组分进行了分析，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定了其分子质量分布，以期为进一步加工利用牡蛎蛋白提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料处理与试剂

牡蛎(大连湾牡蛎，Ostreamtailienwhanensis)，购于大连黑石礁海鲜市场，新鲜贝肉去壳去内脏，清洗干净，匀浆后冷冻干燥得到牡蛎冻干粉；混合蛋白质标准品：Takara宝生物工程有限公司；NaOH、乙醇、三氯乙酸等试剂：均为分析纯。

1.2 仪器设备

BS-224S分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；BL25B36匀浆机：广东美的生活电器制造有限公司；SYG-2恒温水浴锅：常州朗越仪器制造有限公司；H-1850R离心机：湘仪离心机仪器有限公司；SCIENTZ-10ND冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；SP-721E 721分光光度计：上海光谱仪器公司；KDN-08消化炉：金坛市指前镇旭日实验仪器厂；马弗炉；JJ-1磁力搅拌：常州国华电器有限公司；PHS-25 pH计：上海雷磁仪器有限公司；MD 77透析袋(MW：12～14 kDa)：美国联合碳化物公司。

1.3 实验方法

1.3.1 基本成分的测定

水分含量的测定：GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》，直接干燥法；

灰分含量的测定：GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》，灼烧称重法；

粗蛋白质含量的测定：GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》，微量凯氏定氮法；

粗脂肪含量的测定：GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》，索氏抽提法；

总糖含量的测定：GB 5009.7—2016《食品中总糖的测定》，苯酚硫酸法；

1.3.2 最佳碱溶工艺优化

对Palafox H等[7]的方法稍作修改，进行牡蛎分离蛋白的制备。

称取一定质量牡蛎冻干粉，加入蒸馏水溶解后(料液比1∶3)均质化，加入0.1 mol/L NaOH溶液提取分离蛋白，4℃、9 000 r/min离心20 min，收集上清液，测定蛋白质含量。固定碱溶提取条件为提取温度25℃、溶解pH值11.0、提取时间1.5 h。本文考察了提取温度(10、20、30、40、50、60、70、80℃)、溶解pH值(9.0、10.0、11.0、12.0、13.0)和提取时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)三种因素对碱溶过程中牡蛎分离蛋白溶解性的影响。

1.3.3 最佳沉淀pH值工艺优化

通过1.3.2条件制备蛋白提取液后，用0.1 mol/L HCl调节溶液将pH值调节为3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0，在4℃下放置1 h后，4℃、8 000 r/min离心15 min，分别收集沉淀和上清液，上清液采用100 mL容量瓶定容，进行蛋白质含量的测定，从而确定最佳酸沉pH值。

1.3.4 牡蛎蛋白组分分离

参照Osborne分级法[10]对牡蛎匀浆中四种蛋白质进行分级分离。

1)采用500 mL蒸馏水溶解100 g牡蛎冻干粉→室温搅拌2 h→4℃、8 000 r/min离心20 min→沉淀重复水提2次，合并2次上清液→冷冻干燥→水溶性蛋白。

2)在1)所得的沉淀中加入1 000 mL 50 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液(含500 mL 0.5 mol/ L NaCl)进行溶解→室温搅拌2 h→4℃、8 000 r/min离心20 min→沉淀中加500 mL 0.5 mol/L NaCl提取→合并2次上清液→4℃、去离子水中透析(MWCO：8 000 Da)72 h→蛋白质离心→沉淀进行冷冻干燥→盐溶性蛋白。

3)在2)所得的沉淀中加入1 000 mL 45%的乙醇进行溶解→室温搅拌2 h→ 4℃、8 000 r/min离心20 min→沉淀加入500 mL 45%的乙醇后离心→合并2次上清液→浓缩→冷冻干燥→醇溶性蛋白。

4)在3)所得的沉淀中加入1 000 mL 0.05 mol/L NaOH进行溶解→室温搅拌2 h→4℃、8 000 r/min离心20 min→沉淀中加入500 mL 45% NaOH后离心→合并上清液，边搅拌边向其中滴加20%(W/V)三氯乙酸，至三氯乙酸的最终浓度为5%(W/V)→4℃、10 000 r/min离心20 min→沉淀用预冷的丙酮洗涤三次→热风干燥→碱溶性蛋白。

1.3.5 牡蛎各蛋白组分分析

蛋白质含量的测定根据GB 5009.5—2016，蛋白质转换系数为6.25，其中：

1.3.6 牡蛎各蛋白组分SDS-PAGE电泳测定

用5% SDS将1.3.3和1.3.4得到的蛋白质溶解，然后用上样缓冲液(β-巯基乙醇)处理样品，采用R250考马斯亮蓝进行染色。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为5%浓缩胶、12%分离胶。通过Gel-Pro Analyzer分析软件对电泳图谱进行分析。

1.3.7 统计与分析

所有实验均重复三次，实验结果采用平均值±标准偏差的方式进行表述。数据采用SPSS 22.0和Excel进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 牡蛎基本成分组成

牡蛎的基本成分组成结果如表1所示。新鲜牡蛎中水分含量为81.42%，牡蛎冻干粉中粗蛋白含量达到57.21%，总糖含量为33.09%，粗脂肪含量为3.08%，灰分含量为6.48%。结果显示牡蛎中含有丰富的蛋白质，这与邱娟等[11]研究的结果一致。在去内脏牡蛎中，还含有较高含量的灰分，是因为牡蛎中含有相当含量的矿物质元素，如Mg、Ca、Fe、Zn和Al等。

表1 牡蛎基本成分分析(干基)

2.2 等电点沉淀法提取牡蛎蛋白工艺优化

2.2.1 提取温度对牡蛎蛋白含量的影响

提取温度对牡蛎蛋白含量的影响如图1所示。由图所知，在10～80℃的温度范围内，牡蛎蛋白含量随提取温度的增加变化并不显著。并且在高温条件下提取蛋白质的含量并无显著变化，与董淑华等[12]在4～50℃提取鸢乌贼蛋白结果一致。这可能是由于牡蛎蛋白并未发生变性，高温可能只是使其部分蛋白质失活，所以对分离蛋白含量影响不大。因此，在室温条件下进行提取操作即可。

2.2.2 溶解pH值对牡蛎蛋白含量的影响

溶解pH值对牡蛎蛋白含量的影响如图2所示。由图2可知，牡蛎蛋白的含量随pH值的增加呈现先上升后下降的趋势，当pH值为12.0时，牡蛎蛋白含量达到2.8%，之后蛋白质含量下降，可能是过高的pH值造成蛋白质变性，使其沉淀析出，从而使最后上清液中蛋白质含量降低。由此可知，pH值为12.0时，牡蛎蛋白溶解性较好，pH值过高、过低都会造成蛋白含量下降。因此根据实验结果，选取pH值为12.0为最佳提取pH值。

2.2.3 提取时间对牡蛎蛋白含量的影响

提取时间对牡蛎蛋白含量的影响如图3所示。根据图3可知，当提取时间为0.5～1.0 h时，延长提取时间，溶液中牡蛎蛋白含量增加。当提取时间延长至1.0 h以后，其对牡蛎蛋白含量并无明显影响。说明碱提1.0 h，碱溶体系达到平衡。因此选择溶解时间为1.0 h。

2.2.4 沉淀pH值对牡蛎蛋白含量的影响

沉淀pH值对牡蛎蛋白含量的影响如图4所示。当pH值为3.2～4.0时，溶液中蛋白质含量随着pH值的增加呈现下降的趋势，并在pH 值达到4.0时分离蛋白含量最低(0.66%)，pH值在4.0～6.5范围内时，蛋白含量随pH值增加而增加。以上结果说明蛋白最佳酸沉范围在4.0～4.4之间。综合考虑，选择最佳酸沉pH值为4.0。

2.2.5 提取验证试验

综合上述结果确定碱溶提取工艺：在室温条件下，调整溶解pH值为12.0，碱提时间为1.0 h，离心后将上清液pH值调整至4.0，再次离心取沉淀。将沉淀通过8～12 kDa透析袋透析除盐，冷冻干燥后得到牡蛎蛋白。在此条件下制备得到的牡蛎蛋白提取率为65.6%，蛋白纯度为84.3%。陈丽等[13]采用有机溶剂萃取法提取12 h，得到褶牡蛎蛋白提取率仅为21.15%，远低于等电点沉淀法提取牡蛎蛋白的提取率。等电点沉淀法可以有效提高牡蛎蛋白的提取率，为牡蛎产品高附加值加工和利用提供理论依据。

2.3 牡蛎蛋白的分离

去内脏牡蛎肉中富含蛋白质，为明确牡蛎蛋白各组分的含量特点及功能特性，利用传统的Osborne蛋白分级方法，根据每种蛋白组分溶解特性的区别，提取得到四种蛋白组分结果如表2所示。

盐溶性蛋白在肌肉中种类丰富，含量较多。主要由肌原纤维蛋白组成，包括肌球蛋白重链(MHC)、轻链(MYL)、肌动蛋白(Actin)和软体动物特有的副肌球蛋白(PM)和相对分子质量较小的原肌球蛋白等[14]。在牡蛎蛋白中，盐溶性蛋白提取率为49.82%，纯蛋白组分占原料的18.51%，是牡蛎蛋白中优势蛋白组分。水溶性蛋白主要指存在于肌肉细胞肌浆中的肌浆蛋白，主要成分是代谢相关的酶蛋白，如乳酸脱氢酶、醛缩酶、TG酶等，其成分较为复杂[15]。牡蛎肌肉中水溶性蛋白纯蛋白组分占原料的8.82%，提取率为12.03%，相比较鱼台鱼蛋白中水溶性蛋白的含量(76.12%)，牡蛎蛋白中水溶性蛋白含量较少[16]。碱溶性蛋白和醇溶性蛋白提取率分别为14.64%和7.42%，其纯蛋白组分分别占原料的10.49%和1.44%。因此，牡蛎蛋白各级组分中含量依次为盐溶性蛋白>碱溶性蛋白>水溶性蛋白>醇溶性蛋白。将该结果与张晶晶等对近江全牡蛎蛋白各组分含量分析结果[17]进行比较发现，全牡蛎蛋白中水溶性蛋白含量较高(37.79%)，而盐溶性蛋白含量(31.10%)低于去内脏牡蛎(49.82%)，这可能是由于在去除内脏的过程中造成了内源性蛋白酶的大量损失，从而造成水溶性蛋白含量较低。

表2 牡蛎各蛋白组分的提取结果

注：提取率为3次提取得率平均值±SD。

Note：Values were shown as mean±standard deviation of three determinations.

2.4 牡蛎各级蛋白分子量分布

目前，SDS-PAGE技术已被广泛应用于水产蛋白质分子量分布的研究[17-18]。本研究以β-巯基乙醇为上样液，比较了经上样液处理和未经上样液处理的样品差异性，并对等电点沉淀法提取的分离蛋白、盐溶性蛋白、水溶性蛋白、碱溶性蛋白和醇溶性蛋白的分子量分布进行了分析，结果如图5所示。

注：泳道M：Marker标准蛋白；泳道 1～5(经β-巯基乙醇处理的样品)，依次为pH调节法制备的分离蛋白、水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白和碱溶性蛋白；泳道 6～10(未经 β-巯基乙醇还原处理的蛋白样品)，依次为pH调节法制备蛋白、水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白和碱溶性蛋白。

Notes：Lane M：Marker standard protein；Lane 1 to 5(Samples were treated with β-mercaptoethanol)：isoelectric precipitation of protein，water-soluble protein，salt-soluble protein，alcohol-soluble protein and alkali-soluble protein，respectively；Lane 6 to 10(Samples were not treated with β-mercaptoethanol)：isoelectric precipitation of protein，water-soluble protein，salt-soluble protein，alcohol-soluble protein and alkali-soluble protein,respectively.

β-巯基乙醇能够打开蛋白质的二硫键，使蛋白质中的亚基游离出来，所以通常经过β-巯基乙醇处理后的样品电泳条带比未经处理的样品电泳条带多[19]。通过等电点沉淀法制备的蛋白质样品分子量分布比较分散，经上样液处理后的蛋白在44.3 kDa处有明显的条带，而未经上样液处理后的蛋白在97.2 kDa处有明显的条带。这可能是由于β-巯基乙醇使97.2 kDa处蛋白质二硫键打开释放出亚基。

β-巯基乙醇处理后牡蛎盐溶性蛋白分布范围为200.0～250.0 、97.2～200.0、44.3 kDa三部分，所对应的蛋白种类为MHC、PM和Actin。这一结果与贻贝蛋白的电泳条带分布情况[20]相似。但MHC和PM的电泳条带颜色比较浅，说明蛋白含量不高。而未经上样液处理的样品中蛋白主要分布在20.1～40.3 kDa，且经上样液处理的样品中含有分子质量为14.3 kDa的泳道，在同类研究中发现类似特征的蛋白条带，此条带可能是贝类所具备的独特蛋白结构[17]。

水溶性蛋白的分子量分布比较分散，此结果与曹文红等[21]脊尾白虾水溶性蛋白电泳分布结果类似，未经上样液处理的水溶性蛋白在200.0～250.0、97.2与14.3 kDa处有明显条带，与之相比，上样液处理后水溶性蛋白在200.0～250.0、44.3和14.3 kDa处有明显的蛋白条带；上样液处理后醇溶性蛋白在44.3 kDa处有明显的蛋白条带，而未经上样液处理的样品在97.2 kDa存在蛋白条带，推测可能由于β-巯基乙醇处理后蛋白质二硫键被打开，生成了新的结构。但醇溶性蛋白在泳道中颜色浅，说明其含量所占比例较小；碱溶性蛋白的分子量分布比较分散，此结果与郑惠娜等[22]研究结果类似。经β-巯基乙醇处理后碱溶性蛋白在200.0、44.3与20.1 kDa处有明显的蛋白条带，而不经β-巯基乙醇处理后碱溶性蛋白在97.2和200.0 kDa处有明显的蛋白条带。

3 结论

本研究采用等电点沉淀法对牡蛎蛋白提取条件进行了优化，并系统地探索了牡蛎各蛋白组分及其分布特性。在室温、溶解pH 12.0、提取时间1 h、酸沉pH 4.0条件下提取牡蛎蛋白，得到牡蛎蛋白纯度高达84.3%，且该牡蛎蛋白中盐溶性蛋白含量最高，为18.5%，水溶性蛋白、醇溶性蛋白和碱溶性蛋白含量分别为8.8%、1.4%和10.5%。对牡蛎蛋白各组分分子量分布进行分析后发现，牡蛎蛋白中盐溶性蛋白和水溶性蛋白种类丰富，且各组分经β-巯基乙醇处理后出现新的条带，这可能是由于蛋白质二硫键被打开，使亚基游离出来。值得注意的是在同类研究中发现与分子量分布在14.3 kDa蛋白条带特征类似的条带，推测可能是贝类特有的蛋白质，但该蛋白结构和功能尚不清楚，下一步将对其进行更深入地研究与讨论。