鼠妇乙酸乙酯提取物抗炎镇痛作用研究

段哲萍,于新江,张 卉,吴大勇,李菁菁

(1. 河北省人民医院,河北 石家庄 050051；2. 河北医科大学，河北 石家庄 050017)

疼痛是晚期恶性肿瘤患者的常见症状，临床上应用非甾体抗炎药，曲马多、吗啡，羟考酮、芬太尼等三阶梯止痛药可以有效控制癌痛，但三阶梯止痛药物有剂量依赖性、成瘾依赖性(指药物与机体相互作用所造成的一种精神状态及身体状态，患者表现出一种强迫性连续定期用该药的行为，目的是要去感受药物的精神效应，或是为了避免由于断药所引起的不舒适)，且强阿片类药物有严重的毒副作用如恶心、呕吐、反酸、慢性胃炎、便秘、尿潴留、嗜睡、头晕、认知能力下降、呼吸抑制、体位性低血压等[1-4]，故寻求镇痛效果稳定而躯体及精神依赖性小、安全性高的药物是目前研究的热点。近年来研究发现，鼠妇提取物具有明显镇痛作用，可用于各类疼痛的治疗，但其机制尚不十分明确[5-7]。本研究探讨了鼠妇乙酸乙酯提取物的镇痛作用、成瘾性及相关作用机制，现将结果报道如下。

1 实验资料

1.1实验动物及药品 体质量20 g左右的清洁级昆明小鼠120只，雌雄各半，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号:scxk(桂)20170002。鼠妇乙酸乙酯提取物由河北中医学院药学院制备、鉴定、浓度测定，李爱英教授赠送。冰醋酸(北京精细化学用品有限责任公司)，吗啡注射液(华北制药厂，10 mg/支)，盐酸纳洛酮(北京四环医药股份有限公司，0.4 mg /支)，生理盐水(北京四环医药股份有限公司)，环氧化物水解酶(COX)试剂盒(Cayman公司，美国)。

1.2实验方法

1.2.1冰醋酸诱发小鼠扭体法镇痛实验 随机取上述昆明小鼠40只，雌雄各半，禁食12 h后随机分为4组，每组10只。生理盐水组小鼠给予皮下注射生理盐水10 mL/kg，鼠妇低、中、高剂量组小鼠分别皮下注射鼠妇乙酸乙酯提取物50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg(参考文献[6]确定给药剂量)，干预30 min后，每只小鼠腹腔注射1.0%冰醋酸10 mL/kg致痛，观察记录20 min内每只小鼠产生扭体反应的次数，并计算扭体反应抑制率。扭体反应抑制率=(对照组扭体反应次数均数-给药组扭体反应次数均数)/给药组扭体反应次数均数×100%。

1.2.2吗啡刺激小鼠S形竖尾成瘾性实验 随机取上述昆明小鼠40只，雌雄各半，禁食12 h后随机分为吗啡组和鼠妇低、中、高剂量组，每组10只。4组小鼠均给予皮下注射吗啡注射液15 mg/kg(参考文献[6]确定给药剂量)，鼠妇低、中、高剂量组小鼠注射吗啡后分别皮下注射鼠妇乙酸乙酯提取物50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg，均1次/d,连续注射15 d，每日给药后15 min记录各组小鼠S形竖尾反应情况。

1.2.3纳洛酮催瘾小鼠跳跃成瘾性实验 取剩余40只小鼠，禁食12 h后随机分为吗啡组和鼠妇低、中、高剂量组，每组10只。4组小鼠均给予皮下注射吗啡注射液100 mg/kg(参考文献[7]确定给药剂量，使小鼠成瘾)，鼠妇低、中、高剂量组小鼠注射吗啡后分别皮下注射鼠妇乙酸乙酯提取物50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg，均每12 h 1次，连续7 d，注射结束后6 h，每组小鼠均给予皮下注射纳洛酮注射液5 mg/kg催瘾，随即将小鼠放于圆形实验台上(高30 cm，直径30 cm)，记录30 min内每组跳跃小鼠数。

1.2.4鼠妇乙酸乙酯提取物对COX酶的抑制实验根据COX酶试剂盒的具体实验步骤进行操作。取96孔板，分成8组，每组3孔。每孔中均加入160 μL缓冲液、10 μL血红素液、10 μL DMSO。设置空白对照组；阳性对照组再加入10 μL COX酶溶液；各给药组除加入10 μL COX酶溶液外，再分别加入10 μL不同浓度的鼠妇乙酸乙酯提取物(7.5 ng/mL、15 ng/mL、30 ng/mL、60 ng/mL、120 ng/mL、240 ng/mL)；8组均加入20 μL显色剂及20 μL酸剂，混匀，放置5 min后于酶联免疫检测仪590 nm处测定吸光值并记录，计算抑制率。抑制率=[1-(给药组吸光值均数-空白组吸光值均数)/(对照组吸光值均数-空白组吸光值均数)]×100%。

2 结 果

2.1各组冰醋酸诱发小鼠扭体反应情况 鼠妇各剂量组小鼠扭体次数均明显少于生理盐水组(P均<0.05)。鼠妇各剂量组的扭体反应抑制率随鼠妇乙酸乙酯提取物剂量的增加而升高，呈现剂量依赖关系；鼠妇中剂量组的扭体反应抑制率达74.002%，为最佳试验药物浓度。见表1。

表1 鼠妇乙酸乙酯提取物对冰醋酸诱发小鼠扭体反应的影响

注：①与生理盐水组比较，P<0.05。

2.2各组吗啡刺激小鼠竖尾情况 吗啡组小鼠注射吗啡注射液15 min后均出现S型竖尾现象,而鼠妇各剂量组小鼠均未出现S型竖尾现象。

2.3各组纳洛酮催瘾小鼠跳跃情况 吗啡组小鼠注射纳洛酮注射液催瘾后，在高台上均出现跳跃现象；鼠妇各剂量组小鼠注射纳洛酮注射液催瘾后均未出现跳跃现象。

2.4鼠妇乙酸乙酯提取物对COX酶的抑制情况 鼠妇乙酸乙酯提取物对COX-1酶和COX-2酶均有抑制作用，且随药物浓度的增加抑制作用逐渐增强，其对COX-1酶的抑制作用优于对COX-2酶的作用。鼠妇乙酸乙酯提取物对COX-1酶的IC50为22.723 ng/mL，对COX-2酶的IC50为33.512 ng/mL。见图1。

图1 不同浓度鼠妇乙酸乙酯提取物对COX酶的抑制情况

3 讨 论

鼠妇又名湿虫、潮湿虫、地虱等，是无脊椎动物节肢动物门甲壳纲潮虫亚目潮虫科鼠妇属，味酸、性凉、无毒。鼠妇主要药用有效成分有蛋白质、黏多糖、软骨素、蚁酸、还原糖、多种饱和及不饱和脂肪酸等，而各种溶剂提取的药用成分也不尽相同[8-9]。目前鼠妇常用的提取方法有蒸馏法、酸碱法、酶提取法等，常用的有机溶剂有水、葡萄糖、乙醇、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、氯仿等，其中鼠妇水提取物的主要成分为甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、γ-氨基丁酸、亮氨酸、异亮氨酸等多种蛋白多肽[10]；鼠妇乙酸乙酯提取物的主要成分是甾体类化合物，包括β-谷甾醇、7α-羟基胆固醇、7β-羟基胆固醇、麦角甾醇、5-烯-3β-胆固醇等[7]。本实验观察了鼠妇乙酸乙酯提取物的镇痛作用、安全性，结果显示鼠妇各组的扭体次数均明显少于生理盐水组，鼠妇低、中、高剂量组扭体反应抑制率分别为39.252%，74.002%，96.794%，说明鼠妇乙酸乙酯提取物具有确切的镇痛效果，且呈剂量依赖性。2个成瘾性实验结果显示，鼠妇各剂量组小鼠成瘾反应均未引出，提示鼠妇乙酸乙酯提取物的镇痛作用不具有成瘾依赖性，说明鼠妇乙酸乙酯提取物3个剂量范围内的实验用药安全可靠。

前列腺素(PG)是重要的致痛物质，而COX酶是催化花生四烯酸转化为PG合成过程中的所需酶，也是PG合成初始过程中的关键限速酶。非甾体类抗炎药就是通过抑制PG生成的COX酶途径而发挥抗炎镇痛作用的[11-12]。COX酶是一种双功能酶，具有环氧化酶和过氧化氢酶活性，可以催化多种环氧化物和芳烃氧化物的水解过程[13-14]。目前发现COX酶具有2种同工酶，即COX-1酶和COX-2酶。COX-1酶为结构型，是要素酶，广泛存在于胃、血管、肾等正常组织中，它催化生成的PG参与机体正常的生理过程，如可调节胃黏膜周围的血流、胃黏液的分泌，从而起到保护胃黏膜的作用；可调节血小板的聚集、外周血管阻力及肾脏血流量分布，具有保护功能[15-16]。COX-2酶为诱导型，是诱导酶，即给予一定刺激后迅速产生的酶，可由多种化学、物理和生物因子损伤性刺激而诱导产生，激活的磷脂酶A2水解细胞膜磷脂，生成花生四烯酸，后者经COX-2酶催化加氧生成PG，催化PG合成参与炎症反应的过程[17-19]。本实验结果显示，鼠妇乙酸乙酯提取物对COX-1酶和COX-2酶均有抑制作用，且对COX-1酶的抑制作用优于对COX-2酶的作用，并随给药浓度的增加抑制作用逐渐增强。表明鼠妇乙酸乙酯提取物是通过抑制COX-1酶、COX-2酶而起到镇痛作用的。

综上所述，鼠妇乙酸乙酯提取物对于疼痛模型小鼠具有明显镇痛作用，且该作用无成瘾性，其是通过抑制COX酶途径而发挥抗炎镇痛作用的。