针刺对组胺致痒小鼠5-羟色胺及其受体表达的影响

赵一丁，闫婵娟，闫小宁

(陕西省中医医院，陕西 西安 710003)

瘙痒的定义最早由德国医生Samuel Hafenreffer于350年前提出[1]，其是一种可引发搔抓意愿和搔抓反射的特异性皮肤感觉，是特应性皮炎、银屑病、荨麻疹等多种皮肤疾病的常见表现。瘙痒的产生涉及复杂的信号传导通路，主要包括组胺依赖性瘙痒和非组胺依赖性瘙痒2种机制。5-羟色胺(5-HT)是一种重要的内源性致痒物质，通过组胺依赖性通路传导激活感觉神经元而产生痒觉信号。针刺对瘙痒具有不同程度的抑制作用，但其机制尚不清楚，故本研究通过构建组胺依赖性瘙痒小鼠模型，观察针刺穴位对模型小鼠体内5-HT及其受体的表达影响，探讨了针刺对瘙痒调控的作用机制。

1 实验资料

1.1实验动物 健康C57B/6J雄性小鼠30只，SPF级，6～8周龄，体质量20～25 g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供(许可证号：SCXK2012-003)。均饲养于12 h光照/12 h黑暗的环境中，室温控制在18～24 ℃，湿度控制在50%～70%，光照时间8:00—20:00，自由饮水进食。实验过程中对实验动物的处置均符合2006年国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》规定。

1.2主要试剂与仪器 98%组胺二磷酸盐、HTR2B(美国Proteintech公司，26408-1-AP)，Beta-actin(美国Santa Cruz Biotechnology公司，SC-47778)，羊抗鼠二抗(美国PIERCE公司，31430)，羊抗兔二抗(美国PIERCE公司，31460)，考马斯亮蓝R-250、Tween20(均购自美国Amresco公司)，OCT包埋剂(武汉赛维尔生物技术有限公司)，NC膜、BCA kit、Supersignalwest pico(均购自美国PIERCE公司)，RIPA蛋白裂解液(上海邦奕生物科技有限公司)，Cocktail蛋白酶抑制剂(德国Roch公司)，5-HT酶联免疫分析试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。超低温冰箱(日本SANYO)，台式离心机(美国Benchmark)，电热恒温培养箱(上海生工生物工程股份有限公司)，蛋白垂直电泳槽(美国Biorad公司)，蛋白湿转仪(美国Biorad公司)，电泳仪(北京六一仪器厂)，摄像机(日本SONY)，50 μL微注射器，一次性30号毫针，微计量器，血管钳，手术刀，眼科剪。

1.3分组、造模及干预 应用随机数字表将30只C57B/6J小鼠随机分为模型组、针刺组和生理盐水组，每组10只。实验前所有小鼠放入透明树脂盒内每天适应1 h，连续3 d后开始实验。实验第1天，各组小鼠颈背部(肩胛连线中点上方约5 mm处)皮肤刮毛，将小鼠放入透明树脂盒内适应1 h后，生理盐水组于小鼠颈背部刮毛区注射生理盐水50 μL，模型组和针刺组于小鼠颈背部刮毛区皮内注射磷酸组胺50 μL，然后立即放入透明树脂盒子内观察小鼠行为学变化，第2天操作同第1天，同时针刺组开始针刺干预，小鼠穴位定位及针刺深度均参照《实验针灸学》[2]，将30号毫针直刺双侧血海、曲池及合谷穴5 mm，采用提插和捻转手法刺激，留针20 min，每天1次，共针刺2 d。各组第3天操作同第2天。

1.4观察指标

1.4.1行为学观察 各组小鼠自第1次颈部皮下注射致痒剂/生理盐水当日起开始行为学观察，观察过程中保持室内安静无人，摄像机录像40 min，实验结束后回放录像观察小鼠活动情况。瘙痒行为学以搔抓次数进行评判：以小鼠后爪离开盒子底面并搔抓皮肤，到其后爪落地或舔舐其后爪为一次完整的搔抓动作，在此期间不管搔抓多少次，均记为1次[3]。由2名不参加实验的工作人员记录小鼠搔抓次数。

1.4.2血清5-HT水平 实验结束后，取各组小鼠眼球血2 mL，置于对应标号的采血管中，在离心机中以1 500 r/min离心20 min，收集血清置于-80 ℃冰箱保存，采用ELISA法、按试剂盒中说明方法测定血清5-HT水平。

1.4.3延髓组织中5-HT受体表达情况 采用Western-blot法检测。实验结束后，腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉各组小鼠，然后固定在操作台上，迅速开胸，提拉胸骨柄，完全暴露小鼠心脏，使用6号静脉输液器插入左心室后，用血管钳固定好输液器进针处，并夹闭心脏，剪开右心耳，打开静脉输液器最快滴速注入生理盐水，观察小鼠肝脏及肠管，待肝脏由红色变为白色、肠管鼓胀后，四肢及尾部僵直，迅速紧贴小鼠枕骨下用剪刀断头，剔除多余皮肤、肌肉组织，用弯钳剪去颅骨，将大脑沿腹侧剥出并置于冰面上，切除小脑后定位延髓上、下界，取延髓置于冻存管内迅速放入液氮中冻存，后置于-80 ℃冰箱中保存。检测时取出-80 ℃冰箱保存的延髓组织，称质量后在研钵中倒入液氮，研碎组织块后移入EP管中，在管中加入RIPA蛋白裂解液(每克组织3 mL)、蛋白酶抑制剂Aprotinin，充分裂解后取上清液置于新EP管内，冰上保存，将各样品蛋白液1∶50稀释，参照BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白测定，每个样品取相同质量的蛋白，加入5×loading buffer后沸水煮10 min使蛋白变性；将制备好的10%凝胶板放入电泳槽内，倒入1×Running Buffer，用细枪头加样，确定加样顺序和计算加样量；将电泳槽与电源连接好，以90 V稳压状态电泳，当溴酚蓝进入分离胶时将电压调整至100 V，待溴酚蓝电泳至分离胶底部停止电泳；按方向依次放好滤纸、胶、膜，直至整个夹板保持紧密，用含5%脱脂奶粉的TBS封闭，可在室温封闭4 h；结合一抗，在4 ℃过夜，HTR2B(1∶1 000)，室温漂洗3次，每次10 min，结合二抗，室温结合2 h；羊抗鼠二抗(1∶10 000)、羊抗兔二抗(1∶10 000)，室温漂洗3次，每次10 min，最后一次用TBS漂洗以去除吐温；化学发光，于暗室中曝光操作，梯度曝光10 s～5 min。

2 结 果

2.1各组小鼠搔抓次数比较 模型组和针刺组小鼠造模第1，2，3天搔抓次数均明显多于生理盐水组(P均<0.05)，模型组小鼠造模第1，2，3天搔抓次数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；针刺组小鼠造模第1，2天搔抓次数比较差异无统计学意义(P>0.05)，但造模第3天搔抓次数明显少于第1，2天及模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠搔抓次数比较次/40 min)

注：①与生理盐水组比较，P<0.05；②与造模第3天比较，P<0.05；③与模型组比较，P<0.05。

2.2各组小鼠血清5-HT及延髓组织中5-HT受体表达水平比较 模型组和针刺组小鼠血清5-HT水平和延髓组织中5-HT受体表达水平均明显高于生理盐水组(P均<0.05)，针刺组小鼠血清5-HT水平明显低于模型组(P<0.05)；针刺组与模型组小鼠延髓组织中5-HT受体表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2及图1。

3 讨 论

瘙痒是许多皮肤疾病常见而棘手的临床表现，如特应性皮炎、荨麻疹、皮肤瘙痒症、银屑病等。中医认为瘙痒由风、湿、热、虫、毒之邪气郁于皮肤腠理之间，使其气血不和，肤失濡养，郁而生微热所致，或由于血虚风燥阻于皮肤，肌肤失养，内生虚热而发。针灸可通过穴位刺激激发机体的自愈能力，达到疏风解表、清热祛湿、杀虫止痒、调和气血的作用[4]。大量研究证实针刺对瘙痒性疾病具有很好的疗效[5]，但对于针刺止痒的机制研究主要围绕外周瘙痒递质的变化来展开，缺少对高级中枢的研究。

表2 各组小鼠血清5-HT及延髓组织中5-HT受体表达水平比较

注：①与生理盐水组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

图1 各组小鼠延髓组织中5-HT受体表达情况

瘙痒与疼痛同为伤害性刺激，对脊髓上中枢组成的下行调制系统具有激活作用，其中延髓头端腹内侧核(rostral ventromedial medulla,RVM)作为下行系统的重要组成部分，参与多种神经递质对感觉的调控[6]。5-HT是一种重要的内源性致痒物质，广泛存在于外周和中枢神经系统，通过兴奋机械刺激不敏感的无髓鞘C-纤维，这类纤维主要介导组胺依赖性瘙痒信号的传导；5-HT受体为G蛋白偶联受体，其家族中5-HT2受体主要参与痒觉的产生，5-HT2受体通过活化磷脂酶C(phospholipase C,PLC)及丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路，诱导背根神经节神经元内储存的Ca2+释放和细胞外Ca2+内流，增加神经细胞兴奋性，产生痒觉[7]。Liu等[8]研究发现，破坏RVM区5-HT能神经元可明显减少组胺诱发的搔抓次数。邵鹏[9]报道针刺可降低5-HT致痒大鼠血清IgE含量及5-HT2A受体数量。本研究通过建立组胺依赖性瘙痒动物模型，以外周5-HT及其中枢受体的表达为研究靶点，以针刺曲池、血海、合谷为干预措施，探讨了针刺止痒的可能机制。

曲池、合谷属手阳明大肠经，乃多气多血之经，善于开泄，能疏泄蕴于肌肤之邪，达到开腠理、疏风清热止痒的作用；血海属足太阴脾经穴，为血会，具有理血活血、散风除湿的作用，取“治风先治血、血行风自灭”之意。本实验结果显示，组胺致痒动物模型的成功建立可以通过行为学研究证实；针刺组小鼠造模第3天搔抓次数明显少于第1，2天及模型组；模型组小鼠血清5-HT水平及延髓5-HT受体表达水平均明显高于生理盐水组，针刺组小鼠血清5-HT水平明显低于模型组，针刺组与模型组小鼠延髓5-HT受体表达水平比较差异无统计学意义。提示针刺对组胺致痒模型小鼠的搔抓行为具有抑制作用，并且可以下调血清5-HT水平，为针刺治疗组胺依赖性瘙痒性皮肤病提供了一定科学依据。