补肾柔肝方对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1-Smads信号通路的干预作用

郑亚江，吴 樱，洪蔚蔚，祝峻峰

(上海市中医医院,上海 200071)

在各种致病因素长期、反复刺激下，肝细胞变性坏死，肝内血管扭曲变形，大量结缔组织增生，胶原纤维伸入肝小叶中形成纤维间隔并重新分隔，即为假小叶，正常肝组织遭到破坏，从而最终进展到肝硬化[1-2]。而作为一种组织病理学概念，肝纤维化是肝硬化进展过程中的重要环节。笔者前期研究证实，中药复方补肾柔肝方对各种病因引起的肝纤维化安全、有效[3]。本实验旨在通过观察肝纤维化大鼠TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ以及Smad2、Smad3表达情况，探讨补肾柔肝方对TGF-β1-Smads信号途径的影响，明确其作用机制。

1 实验资料

1.1动物 清洁级Wistar雄性大鼠53只，体质量180～200 g，购自西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证书：SCXK(沪)2008-0016，由上海中医药大学实验中心提供。

1.2药物和试剂 补肾柔肝方(由淫羊藿、丹参、鳖甲、黄芪、苦参等组成)制成流浸膏(3.5 g/mL)备用；秋水仙碱由云南植物药业有限公司提供(编号01420249708)；TβRⅠ、TβRⅡ均来自Santa Cruz Biotechnology，Inc，USA，批号分别为sc-399、400；PT-RCR反转录试剂盒，Fermentas公司RevertAidTMFrist Strand cDNASyntheisis Kit，K1622。

1.3仪器 台式离心机(microfuge lite)，Beckman公司；HW-8B型旋涡混合器，江苏海门麒麟医用仪器厂；隔水式电热恒温培养箱，上海市跃进农场医疗器械厂；冷冻高速离心机，Varifuge 20RS，Heraeus公司；LEICA EG1160 石蜡包埋机；紫外可见光分光光度计UV2102 C型，Unico公司。

1.4模型制备 随机将大鼠分成空白组8只、模型组15只、补肾柔肝方组15只、秋水仙碱组15只。空白组大鼠首次在背部皮下注射生理盐水5 mL/kg，以后注射花生油3 mL/kg，其余各组大鼠首次均注射等体积的纯四氯化碳，3 d后注射40%四氯化碳-花生油3 mL/kg，每周造模2次，连续8周。第9周开始，补肾柔肝方组、秋水仙碱组分别给予补肾柔肝方流浸膏5 mL/(kg·d)、秋水仙碱水溶液5 mL/(kg·d)灌胃，而空白组、模型组分别给予等体积生理盐水灌胃，共8周，实验期间所有大鼠均标准饮食。实验结束后，模型组存活11只，补肾柔肝方组和秋水仙碱组各存活14只。

1.5样本采集 最后一次灌胃后，禁食24 h，在无菌、无热源条件下，乙醚麻醉大鼠，从大鼠腹主动脉采血，注入用肝素115×104IU/L处理的无热源玻璃试管中，4 ℃离心，将分离血浆放入试管中封口，-80 ℃保存。所采肝组织标本都必须确保取自每只大鼠的相同部位，用甲醛固定；其余肝组织-80 ℃低温保存，用以免疫组化以及病理检测。

1.6检测指标

1.6.1肝组织TβRⅠ、TβRⅡ蛋白和Smad2、Smad3水平 取-80 ℃的肝组织，约80 mg/kg，置于玻璃研磨器中，裂解、提取组织蛋白液，BCA法定量，然后经电泳，半干转膜、封闭，分别与Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad 3、TβRⅠ、TβRⅡ一抗(1∶600)4 ℃过夜，最后加入用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)，经过化学发光、显影、压片、灰度扫描后，根据实验组目的蛋白灰度值与模型组目的蛋白灰度值的比值来表示蛋白表达水平。

1.6.2肝组织中TβRⅠ、TβRⅡmRNA表达水平采用RT-PCR法检测。TRIzol试剂法提取肝组织中总RNA，然后按照试剂盒说明书进行RT-PCR扩增。取上述反应产物6 μL置于琼脂糖凝胶电泳，用DNA Maker(DL2000)作为标记，通过紫外透射仪观察，最后拍照，输入电脑，目的电泳条带采用BIO-PROFIF凝胶图像系统(法国VL公司提供)分析，参照物为对应的内参(GAPDH)电泳条带，分别计算两者的积分吸光度，结果以两者的比值表示。

1.6.3肝组织中TGF-β1mRNA表达水平 采用RT-PCR法检测。TRIzol法提取肝组织中总RNA。大鼠TGF-β1、β-action引物来源于bioinformatics软件。按照试剂盒说明书操作，最后取反应产物15 μL置于2.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，采用Band Leader软件分析灰度的信号半定量值，并以各组目的条带灰度值与模型组目的条带灰度值比值表达各相应mRNA水平。

2 结 果

2.1各组大鼠肝组织中TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表达水平比较 与空白组比较，模型组TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表达水平均显著升高(P均<0.05)；与模型组比较，补肾柔肝方组及秋水仙碱组TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表达水平均明显降低(P均<0.05)。见表1及图1。

表1 各组大鼠肝组织中TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表达水平比较

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

图1 各组大鼠肝组织中TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表达情况

2.2各组大鼠肝组织中Smad2、Smad3磷酸化水平比较 各组间Smad2和Smad3磷酸化水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2。

1为空白组；2为模型组；3为秋水仙碱组；4为补肾柔肝方组图2 各组大鼠肝组织中Smad2、Smad3蛋白表达情况

2.3各组大鼠肝组织中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ mRNA表达水平比较 与空白组比较，模型组TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡmRNA表达水平均明显升高(P均<0.05)；与模型组比较，补肾柔肝方组及秋水仙碱组TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ mRNA表达水平均明显降低(P均<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肝组织中TGF-β1、TβRⅠ、 TβRⅡ mRNA表达水平比较

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

3 讨 论

肝脏在各种致病因素长期刺激下发生慢性炎症、坏死、增生，逐渐进展到肝硬化、肝癌，肝纤维化作为一种自身修复反应，是这个发展过程中的必经之路。而通过积极、及时的治疗，肝纤维化多数可以逆转，因此引起广大研究者的关注，成为近年来肝病领域的研究热点。但从目前的临床现状来看，还没有寻找到一个临床疗效确切、无毒副作用、可以广泛推广使用的治疗肝纤维化的有效方案或者药物，这也是目前临床急需解决的问题。

祖国医学中并没有“肝纤维化”的名称，多将其归于“癥瘕”“积聚”“臌胀”“黄疸”“胁痛”等范围。其病因病机为外感湿热疫毒，内蕴中焦，熏蒸肝胆；或饮食不节，恣食肥甘厚味，脾胃运化功能失常，湿浊内生，日久化热，炼液为痰，气机升降逆乱，血液运行阻滞，痰热、瘀血互结。因湿邪黏腻重浊，缠绵难愈，易耗伤正气，形成湿热、疫毒、痰瘀、正虚交结的复杂病理局面。病机特点为本虚标实，虚实夹杂。其病位在肝脾，久病及肾，最终肝、脾、肾三脏俱损。故中医治疗多从肝、脾、肾三脏入手，治以扶正补虚、活血化瘀。 长期临床实践表明，中药复方具有多靶点的作用，可以显著抑制、甚至逆转肝纤维化，比较适合肝纤维化复杂多变的病情[4]。

在长期的临床工作中，名老中医王灵台教授认为肝纤维化病机主要为脾肾亏虚，瘀血阻络，并通过大量临床验证总结出安全、有效的中药复方补肾柔肝方，全方补肾益脾但不滋腻滞气，清热解毒但不伤阴劫液，活血化瘀但不耗血动血，具有补肾填精、健脾益气、软坚散结、清肝利胆的作用，扶正祛邪，标本兼治[5-6]。

TGF-β1是强有力的促进纤维化形成的细胞因子[7]。在肝纤维化过程中，TGF-β1首先干扰肝细胞DNA的合成，抑制肝实质细胞产生，激活星状细胞，从而导致多种胶原成分合成增加，同时基质金属蛋白酶的合成、降解减少，胶原纤维沉积，最终形成肝纤维化[8]。因为在肝纤维化时，TGF-β1的表达水平与组织病理学变化相一致，所以为了明确肝纤维化的进展程度，可以通过检测TGF-β1的表达水平来进行判断[9]。而TGF-β1是通过TGF-β受体发挥生物效应的，其受体是一个跨膜复合物，有3种亚型，与肝纤维化相关的主要是Ⅰ型和Ⅱ型。在通过整合素、基质金属蛋白酶、纤溶酶等作用激活TGF-β1后，胞外活化型的TGF-β1与Ⅱ型受体结合，后者其胞内侧丝氨酸羧基端产生自身磷酸化，从而具有激酶活性，与Ⅰ型受体结合后进一步磷酸化其活化区域，形成一个异四聚体复合物，包括Ⅰ型和Ⅱ型受体各2个。这样，信号就通过已被活化的Ⅰ型受体从胞外传到胞内，作用于目的基因。因此，信号能够通过细胞膜进入胞内是其发挥生物作用的关键[10]。

在肝纤维化相关的所有细胞信号传导通路中，研究最为成熟的就是TGF-β1-Smads通路。Smads蛋白是TGF-β1受体胞内激酶的底物，决定着TGF-β1信号途径跨膜传导的成败。TGF-β1和Smads蛋白共同调节细胞增殖、转化、合成、凋亡[11]。目前Smads家族成员分为3种类型：膜受体调节性Smad(R-Smad，包括 Smad1、Smad 2、Smad 3、Smad 5、Smad 8)、共用介质性Smad(co-Smad：Smad4)和抑制性Smad(I-Smad：Smad6、Smad 7)。其中R-Smad与信号通路的特异性有关，是Ⅰ型受体胞内激酶的特异性底物；co-Smad与其他Smad构成多聚体后，可以进入细胞核调节靶基因；而I-Smad则通过竞争被受体激活的R-Smads或者TGF-β1Ⅰ型受体，使之形成无活性的聚合体或丧失磷酸化，从而阻止信号途径的进一步转导[12]。肝纤维化形成与Smads密切相关，在Smad3的参与下，活化的肝星状细胞才能产生最大效应，合成大量的胶原蛋白。而且在肝损伤的不同阶段，Smads生物效应也不同，急性肝损伤时，Smad2在TGF-β1及受体诱导下产生磷酸化，但其活性受到磷酸化的Smad7负性调节，这样在肝星状细胞内，TGF-β1/Smad信号传导保持平衡状态；而在慢性肝损伤阶段，因为Smad7不能被磷酸化，所以就不能抑制Smad2活化，信号传导平衡状态失衡，Smad2信号得以下传，调控胶原蛋白基因，使之大量转录，慢性肝损伤过程中肝纤维化的形成可能就与这一作用机制有关[12]。

本课题研究结果显示，模型组肝组织中TβRⅠ、TβRⅡ蛋白及TGF-β1、TβRI、TβRⅡmRNA表达水平均显著高于空白组，补肾柔肝方组和秋水仙碱组TβRⅠ、TβRⅡ蛋白以及TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ mRNA表达水平均显著低于模型组，各组间Smad2和Smad3磷酸化水平比较差异均无统计学意义。说明补肾柔肝方可显著降低肝组织中TβRⅠ、TβRⅡ表达水平，但对Smad2和Smad3磷酸化水平无明显影响，表明在TGF-β1/Smads信号传导通路中，补肾柔肝方主要是通过抑制TβRⅠ、TβRⅡ表达，无法磷酸化的Smad2和Smad3失去活性，从而阻断信号通路传导发挥抗纤维化的作用。